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Técnicas que se utilizan normalmente en Proteómica

Una de Western

Excusas para explicar mi prolongada ausencia del blog tengo un montón, pero para que engañarnos, os he dejado de la mano de Dios y no hay perdón posible.

Entre trabajo (muchísimo), familia y las fechas que acaban de pasar, pues nada, el blog es el que pierde… Pero bueno, ya estamos aquí de nuevo con fuerzas renovadas y esperando que este año sea muchísimo mejor que el que ha pasado. A ver si es verdad.

Vamos al tema. El Western… mmmmm….. esa técnica que he aprendido a amar tanto como a odiar. A amarla porque cuando sale el experimento y lo tienes bien puesto a punto es una auténtica delicia, pero mientras la pones a punto o no, la odias a muerte cada vez que ves que el tiempo pasa y que los resultados no llegan. Os explico a mi manera (a nuestra manera) en lo que consiste esta técnica.

 

Imaginad por un momento que hacéis un experimento clásico de proteómica. Hacéis vuestro gel bidimensional, analizáis las imágenes, recortáis las manchas de interés de los geles e identificáis mediante espectrometría de masas la proteína que os está dando diferencia de expresión en vuestros análisis. Hasta ahí, todo correcto.

El siguiente paso sería la validación de los resultados y aquí es donde entra en juego nuestro amigo: El Western Blot.

El Western Blot (WB) es una técnica que nos sirve para detectar una proteína de interés de entre un conjunto complejo de las mismas. Para esa detección se utilizan anticuerpos específicos para esa proteína y después mediante el acoplamiento de distintos reactivos se puede llevar a cabo la visualización de esta proteína en esa mezcla.

Lo primero de todo para hacer un WB es separar la mezcla compleja de proteínas de partida con una electroforesis unidimensional. En este tipo de electroforesis separamos las proteínas únicamente por su tamaño. Las proteínas aparecerán a lo largo del gel de electroforesis formando bandas según su tamaño molecular.

Electroforesis unidimensional. (Fuente: Wikipedia)

A continuación se realiza una transferencia de estas proteínas separadas por tamaño a una membrana de nitrocelulosa o PVDF (Polifluoruro de vinilideno) donde quedarán inmovilizadas y donde se realizarán los tratamientos de detección. La membrana une proteínas de forma inespecífica lo cual podría representar un problema a la hora de realizar esa detección.

Montaje para llevar a cabo la transferencia a la membrana (Fuente: cultek.com)

Por ello, una vez que hemos realizado la transferencia se hace el bloqueo de la membrana. Imaginad que la membrana es como un papel en blanco donde hemos dibujado una serie de bandas, pero queremos rellenar todo este papel en blanco con color para que no nos quede ningún sitio libre donde se pueda dibujar. Eso es lo que hacemos con el bloqueo. El bloqueo se lleva a cabo utilizando leche desnatada, así, las proteínas de la leche nos rellenarán los huecos que han quedado sin proteína en la membrana para que nada más se una a ella.

Ya hemos realizado una electroforesis, una transferencia y hemos bloqueado la membrana. Ahora lo que tenemos que hacer es la hibridación con el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario es un anticuerpo específico producido para reaccionar con nuestra proteína de interés. Este anticuerpo suele producirse en modelos animales (ratón, conejo, cabra, cultivos celulares…) y se purifica. Pero tranquilos, que no hace falta que purifiquemos nada. Actualmente hay muchas casas comerciales (no pienso hacer publicidad) que se dedican a “fabricar” anticuerpos contra todo tipo de proteínas que os podáis llegar a imaginar. Para producir estos anticuerpos lo que hacen es inocular a estos modelos animales la proteína completa o una parte de ella para que su cuerpo produzca anticuerpos contra esa proteína. Una vez que consiguen esto es cuando purifican ese anticuerpo y nos lo venden a precio de oro. Así a bote pronto, os puedo decir que el anticuerpo con el que estoy trabajando ahora cuesta unos 350 €/50ul. Sí, sí, 50 microlitros…

Sigamos… La hibridación con este anticuerpo primario nos permite,  poner una “etiqueta” a nuestra proteína de interés y aquí es donde entra en juego la hibridación con el anticuerpo secundario.

Lo sé, lo sé, anticuerpo primario, anticuerpo secundario… ¡Vaya lío! Nada de eso. Ahora lo vemos.

Pensad por un momento que estamos utilizando un conjunto de proteínas de ratón, que hemos separado, transferido y bloqueado. Nuestra proteína de interés,  vamos a poner por ejemplo, es la GAPDH (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). Entonces tendremos que buscar un anticuerpo primario anti-GAPDH de ratón. Ese anticuerpo puede proceder bien de modelos de ratón, de conejo, etc., pero para no complicar más la cosa vamos a poner que ese anticuerpo anti-GAPDH está “fabricado” en ratón. Hibridamos con nuestro anticuerpo primario.

Ahora que tenemos “la etiqueta” pegada a la GAPDH que tenemos en esas bandas de la membrana tenemos que buscarnos una forma de poder verla. Para eso se utiliza el anticuerpo secundario. Estos anticuerpos suelen estar modificados de forma que nos permitan utilizar métodos de detección enzimática (botina, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina), radiactiva, fluorescente , etc.

Recordad que estamos trabajando con un anticuerpo primario de ratón, por lo que necesitaríamos un anticuerpo general anti-ratón que se una a nuestro anticuerpo primario de forma específica. En eso consiste la hibridación con el anticuerpo secundario, en pegarle multitud de anticuerpos modificados para la detección al anticuerpo primario y por ende para la detección de nuestra proteína.

Detección quimioluminiscente con peroxidasa de rábano (Fuente: Wikipedia)

Por último ya es cuestión de utilizar el método de revelado del WB que hayamos escogido con nuestro anticuerpo primario. En mi caso utilizo para la detección película fotográfica y luminol/peróxido (detección con peroxidasa de rábano) para poder ver esa proteína que estoy buscando.

Para una descripción más detallada de toda la técnica os recomiendo visitar la entrada del WB de la Wikipedia. Creo que lo resumen muy bien, pero seguro que no tan ameno como os lo he explicado yo.

Si tenéis alguna duda o pregunta que hacerme ya sabéis que estoy disponible a través de los comentarios en el blog o en mi twitter @educhicano.

Pues nada más, espero que os haya gustado esta entrada. Un saludo!

Hágase la luz

La luz… Una dualidad onda/corpúsculo que lleva con nosotros desde el comienzo de los tiempos… Y que también sirve, como no, para realizar análisis en Proteómica.
Así a bote pronto se me ha ocurrido explicaros 3 aplicaciones cotidianas en todo laboratorio de Proteomica que se precie que usan la luz como método de análisis o como parte de un análisis.

Luz láser. Fuente

La primera de estas técnicas es una de las mas citadas por todos los artículos proteómicos: la técnica de Bradford.

Esta técnica sirve para medir la cantidad de proteína presente en una muestra. Sí, lo se, lo se, hay mas métodos (por ejemplo, el método de Lowry)  pero al fin y al cabo todos basan su medida final en el resultado que de un espectrofotómetro que va a medir la variación de Absorbancia de luz de una muestra.

En un ensayo de proteínas de Bradford se emplea un colorante hidrofóbico en una mezcla de agua y de ácido fosfórico. Esta mezcla tiene un color pardo-rojizo y suele comprarse en forma de preparado comercial.

La disolución del colorante al entrar en contacto con el interior de una proteína, vira su color de pardo-rojizo a azul. Este cambio de color se puede medir mediante el uso de un espectrofotómetro cuya fuente de emisión de luz se encuentre a 595nm (espectro visible).

Ensayo de Bradford. De izquierda a derecha con cantidades decrecientes de BSA. Fuente

Este método de medida de cantidad de proteína depende de la interacción entre este colorante hidrofóbico y las proteínas y es muy sensible a la presencia de contaminantes (detergentes, orgánicos…) por lo que hay que tener en cuenta como se ha preparado la extracción de proteínas que vamos a medir. Además tiene un rango lineal bajo, por lo que es necesario realizar disoluciones en muchas ocasiones para que la medida quede dentro del rango de medición.

Para superar estas limitaciones existen varias alternativas también basadas en las medidas mediante espectrofotometría y que suelen adquirirse bien preparadas o bien se fabrican de forma “casera” en el laboratorio siguiendo protocolos establecidos a tal efecto.

La principal ventaja del método de Bradford es que es muy fácil de llevar a cabo y muy rápido (a mi no me lleva más de 10-15 minutos) y cosa que no puedo decir de otros métodos alternativos que se me hacen largos y tediosos.

La segunda de las técnicas es la adquisición de imágenes a través de un escáner láser. Así es, podemos iluminar de forma un gel como los de la anterior entrada o cualquier otro teñido con un fluoróforo (Sypro, ProQ Diamond, etc), punto por punto y a la longitud de onda justa para que sólo ese fluoróforo se excite y nos emita luz y obtener una imagen con una calidad excepcional.

Escáner Typhoon de GEHealthcare

Por ultimo y no menos importante, la aplicación de la luz para iniciar el análisis de la secuencia de péptidos e identificación de proteínas. Para esto también utilizamos láser y en concreto lo hacemos para excitar una serie de moléculas de una sustancia que contiene nuestros péptidos. Es lo que se conoce como fuente de ionización Maldi.

La desorción de iones asistida por láser (MALDI: Matrix-assisted laser desorption ionization) es uno de los dos métodos de ionización “suaves” que actualmente se utilizan en espectrometría de masas. Fue desarrollado por Karas y Hillenkamp a finales de los 80.

Las muestras son coprecipitadas en un soporte metálico con una matriz, es decir, una sustancia usada para inmovilizar la muestra y que permitirá ionizar la muestra. Esta matriz suele ser ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnámico, ácido sinapínico o ácido 2,5-dihidroxibenzoico.

Soporte metálico que se utiliza en una fuente de ionización MALDI. Fuente: Eduardo Chicano

Pues bien, el sólido resultante (recordad, mezcla de matriz y nuestros analitos) depositado sobre ese soporte se irradia con pulsos de láser con longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (normalmente láseres de N2 que emiten a 337 nm).

Para que os hagáis una idea, esto es lo que ocurre:

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI. Fuente

El láser provoca que la matriz se excite y literalmente “salte” del soporte, ionizándose de camino junto con nuestros péptidos, que es lo que nos interesa analizar , entrando en la segunda fase de un espectrómetro de masas, el analizador (tipo TOF, cuadrupolo, etc).

Pero la historia de los componentes y tipos de espectrómetros de masas os lo dejo para otro día…

Este Post participa en la VII edición del Carnaval de Biología, albergado por Manuel Sánchez en su blog Curiosidades de la Microbiología

¡No me puedo creer que quiten mi base de datos!

Bases de datos en Proteómica hay muchas. Y para lo que estemos buscando o analizando. Por ejemplo, si estamos buscando propiedades generales de proteínas que hemos identificado, podemos ir a Uniprot. Si queremos estudiar un poco más sobre los dominios de las proteínas en cuestión podemos visitar PfamInterpro… Por el contrario, si lo que queremos es predecir “in-silico” alguna modificación postraduccional en la secuencia de nuestra proteína deberíamos visitar el CBS danés.

Ya lo veis, hay bases de datos para “casi” todo. En general existen bajo mi punto de vista dos gigantes de las bases de datos: EBI (con sus correspondientes bases de datos y montón de aplicaciones) y NCBI (también con sus correspondientes chorrecientas aplicaciones).

Pero menos conocido es el formato de anotación que utilizan estas bases de datos para describir las propiedades de las diferentes proteínas que los científicos nos vamos encontrando a lo largo de años y años de experimentación. Hay anotaciones/bases de datos que son muy populares por este lado del mundo (Europa), como la que yo llamo anotación suiza, la UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot/P00493),  y otras igualmente populares en otros lugares (EEUU) como la anotación/base de datos tipo NCBI.(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_038584.2).

Ambas bases de datos, y en general todas las bases de datos, utilizan diferentes “accession number”, es decir, diferentes codificaciones para identificar la misma proteína dependiendo de la base de datos, el formato que se le de a las anotaciones y la información que contiene esa anotación o descripción de la proteína.

Para muestra, un botón. ¿Os habéis fijado en los dos enlaces anteriores que os he dejado? Seguro que no… 😉 Pues miradlos bien. Es la misma proteína con diferente accesión number (P00493 vs NP_038584.2) dependiendo de si nos encontramos ante una anotación tipo Uniprot o NCBI respectivamente.

Fijaos como dependiendo del accession number podemos tener más o menos información sobre la misma cosa. Para mi gusto es bastante más completo y con mejor estructura el de Uniprot, pero vamos, que si hay que utilizar el del NCBI tampoco le vamos a hacer ascos…

Recientemente he podido leer un artículo (Griss et al, Proteomics October 2011) que se plantea la desaparición del formato de anotación IPI (International Protein Index), una cosa que me afecta directamente a día de hoy ya que la base de datos que descargué en el Servicio de Proteómica de la Universidad de Córdoba (mi segundo laboratorio en la práctica) tiene todas las anotaciones en formato IPI y es con ella y con un programa de espectrometría de masas llamado ProteomeDiscoverer con los que me dedico a identificar proteínas del ratón de campo M. spretus  y sus niveles de expresión mediante la técnica de iTRAQ que ya os explicaré en otro post.

Este formato de anotación tiene la estructura que podéis observar más abajo. Una serie de líneas en las que se nos muestra la identificación para la anotación IPI (ID), el accesion number que posee esa proteína en esta base de datos (AC), los cambios que ha sufrido esta entrada (DT), la descripción (DE), el organismo al que pertenece, en este caso el ratón M. musculus (OS), la clasifición taxonómica (OC), enlaces cruzados con otras bases de datos (DR), la secuencia al final, etc.

ID   IPI00284806.8         IPI;      PRT;   218 AA.
AC   IPI00284806; IPI00131306; IPI00281692; IPI00351673; IPI00381442;
AC   IPI00387495; IPI00626403;
DT   15-MAY-2003 (IPI Mouse rel. 1.12, Created)
DT   07-NOV-2007 (IPI Mouse rel. 3.36, Last sequence update)
DE   HYPOXANTHINE-GUANINE PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE.
OS   Mus musculus (Mouse).
OC   Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
OC   Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.
OX   NCBI_TaxID=10090;
CC   -!- GENE_LOCATION: Chr. X:50341314-50374836:1.
DR   UniProtKB/Swiss-Prot; P00493; HPRT_MOUSE; M.
DR   Vega; OTTMUSP00000018945; OTTMUSG00000017356; -.
DR   REFSEQ_VALIDATED; NP_038584; GI:96975138; -.
DR   UniProtKB/TrEMBL; B1B0W8; B1B0W8_MOUSE; -.
DR   UniProtKB/TrEMBL; Q6TDG6; Q6TDG6_MOUSE; -.
DR   UniProtKB/TrEMBL; Q99KF5; Q99KF5_MOUSE; -.
DR   ENSEMBL; ENSMUSP00000026723; ENSMUSG00000025630; -.
DR   UniParc; UPI0000003E3A; -; -.
DR   MGI; MGI:96217; Hprt; -.
DR   Entrez Gene; 15452; Hprt; -.
DR   UniGene; Mm.299381; -; -.
DR   CCDS; CCDS40972.1; -; -.
DR   trome; MTR002853; -; PRT.
DR   EPD; EP07058; MM_HPRT; Transferase.
DR   CleanEx; MM_HPRT1; -; -.
DR   InterPro; IPR005904; Hxn_phspho_trans.
DR   InterPro; IPR002375; Pr/py_Pribosyl_transf_CS.
DR   InterPro; IPR000836; PRibTrfase.
DR   Pfam; PF00156; Pribosyltran; 1.
DR   TIGRFAMs; TIGR01203; HGPRTase; 1.
DR   PROSITE; PS00103; PUR_PYR_PR_TRANSFER; 1.
SQ   SEQUENCE   218 AA;  24570 MW;  925CC0D4A6626E05 CRC64;
     MPTRSPSVVI SDDEPGYDLD LFCIPNHYAE DLEKVFIPHG LIMDRTERLA RDVMKEMGGH
     HIVALCVLKG GYKFFADLLD YIKALNRNSD RSIPMTVDFI RLKSYCNDQS TGDIKVIGGD
     DLSTLTGKNV LIVEDIIDTG KTMQTLLSLV KQYSPKMVKV ASLLVKRTSR SVGYRPDFVG
     FEIPDKFVVG YALDYNEYFR DLNHVCVISE TGKAKYKA

Lo que tenemos ante nosotros es un fichero de texto plano muy útil y con bastante información que puede utilizar rápidamente el programa en cuestión que estemos utilizando para realizar nuestras búsquedas, ya que este programa normalmente se va a fijar en la primera columna (ID, AC, DT, DE, OS, OX, etc) para realizar un índice de todas las proteínas de la base de datos que tenemos anotadas bajo este formato y después va a darnos los resultados en función de los parámetros de búsqueda que estemos fijando.

Como os digo, el artículo (publicado hoy mismo) analiza las consecuencias de no continuar con la base de datos IPI y para ello realiza distintos test en la esta base de datos y en la que va destinada a sustituirla (UniprotKB). Bueno, de hecho ya la ha sustituido ya que como veréis en el siguiente link del EBI, la base de datos IPI “se ha cerrado”.

Estos científicos del EMBL (European Molecular Biology Laboratory) han realizado dos tipos de test de “mapeo” o búsqueda de las mismas proteínas sobre ambas bases de datos completas para comparar la coincidencia entre ambas bases de datos utilizando para ello la herramienta PICR (Protein Identifier Cross-Reference Service) del EBI.

En el primer test han utilizado PICR para comprobar la cantidad de referencias cruzadas que tenían las proteínas de IPI con respecto a otras bases de datos. Este test lo hicieron para comprobar cuantas entradas de la base IPI estaban representadas en la base UniprotKB a nivel de ID de proteína.

En el segundo test también utilizan PICR pero en esta ocasión utilizan como base de comparación que las secuencias de cada proteína sean idénticas entre ambas bases de datos para que no exista error de identificación entre ambas bases de datos.

Bien, pues lo que han averiguado me ha dejado perplejo a la par que un poco preocupado.

Con el primer test y la base IPI para humanos (la llamaremos IPIh) han descubierto que sólo el 70% de las proteínas se hallaban como ID única en UniprotKB, un 8% aproximadamente de la IPIh estaba relacionada con varias ID (mapeaba con varias ID) y un 21% no se encontraba (no había mapeo) en la base UniprotKB.

Con el segundo test (el de comparar homología de secuencias entre ambas bases de datos), el resultado fue que el 67% de las proteínas de la base IPIh se encontraba en la base UniprotKB con ID única, un 8% mapeaba con varias ID y un 25% directamente no mapeaba.

En el caso de los ratones, la base de datos IPI para ratón M. musculus (llámemosla IPIm), que es la base de datos que utilizo los resultados fueron idénticos tanto para el primer test como para el segundo, 78% mapeados con ID única, 12% con varias ID y 10% sin mapear.

Además de estos resultados con estos dos tests, este grupo de científicos realizó una digestión “in silico” de ambas bases de datos, de las cuales no os pongo los resultados porque son un poco más difíciles de ver, pero que me tranquilizaron aun menos…

Y preguntaréis, si bueno, ¿ y que? Pues la parte preocupante es que en la base IPIh tenemos entre un 21-25% de proteínas que literalmente perdemos como consecuencia de la sustitución de una base de datos por otra. Y en la IPIm tenemos un 10% de la base de datos que me va a desaparecer.

¿Consecuencias de esto? Pues que las identificaciones basadas en estos sets de la base de datos IPI que no puedan “mapearse” en Uniprot se perderán para análisis futuros (literalmente según el artículo), o lo que es lo mismo, se perderán en el olvido…

Esto nos afecta por ejemplo, si como es mi caso, estamos utilizando una base de datos “obsoleta” (bueno, defínanme obsoleta si la discontinuaron el mes pasado…) para (a nivel de espectrometría de masas) identificar proteínas que intervienen en nuestro experimento y queremos publicar los resultados. Los colegas que quieran repetir estos resultados tendrán que tener en cuenta este “handicap” ya que se podrán encontrar con que nosotros hemos identificado proteínas que supuestamente no existen al no estar incluídas dentro de la base de datos UniprotKB que es la actual y pueden acusarnos de dar datos erróneos.

Por eso, siempre, y digo siempre, os recomiendo tener una base de datos actualizada a la última versión cuando se trate de investigar cualquier tipo de análisis en proteómica y en general en cualquier campo en el que nos dispongamos a utilizar una base de datos.

Este Post participa en la VI edición del Carnaval de Biología, albergado por Copépodo en su blog Diario de un Copépodo.

Secuenciación de Edman

Volviendo la mirada hacia las entradas del blog, me he dado cuenta de que hay algunas cosas que asumo como que ya las conocéis y puede ser que no sea así. Por eso hoy vamos a explicar brevemente, o lo más brevemente posible como fue el origen de la secuenciación de las proteínas.

La secuenciación de proteínas fue (según mi humilde opinión) uno de los hitos históricos a tener en cuenta para las personas que trabajamos con las mismas ya que sin ella (y varias cosas más),  probablemente no tendríamos Proteómica…

Pehr Victor Edman

Todo comienza con la labor de un joven científico llamado Pehr Victor Edman. En aquellas fechas se acababa de reconocer que las proteínas eran entidades con una estructura, una masa y una carga eléctrica definidas. Este hombre, como muchos de nosotros, se encontraba centrado en investigación básica en Estocolmo, en el Instituto Karolinska, haciendo su trabajo para su tesis doctoral cuando se le cruzó en medio una guerra. Era una época muy dura, y tras servir en el ejército sueco durante la Segunda Guerra Mundial continuó sus trabajos y en 1947 le concedieron un premio para ir al Rockefeller Institute of Medical Research en la prestigiosa Universidad de Princeton donde realizó sus trabajos de purificación y caracterización de la Angiotensina de sangre bovina.

En aquellos años colegas físico-químicos suecos habían descubierto que proteínas de diferentes tamaños moleculares poseían estructuras químicas específicas y más que probablemente individuales.Edman estaba muy interesado en la determinación detallada de la estructura de las proteínas y  con su método consiguió dar lugar a una explicación estructural de sus diversas actividades biológicas.

Para su doctorado, Edman aisló de la sangre bovina una proteína pequeña que regula la presión arterial (Angiotensina), pero pronto se dio cuenta de que las proteínas están constituidas por pequeños “bloques o ladrillos”: los aminoácidos. Para dar una explicación estructural a las diversas actividades biológicas de las proteínas debía encontrar un método que le permitiera una determinación de la estructura de las mismas.

A Edman se le ocurrió la fantástica idea de una serie de reacciones basadas en el acoplamiento del fenilisotiocianato (PITC) con una proteína purificada y el uso de hidrólisis ácida. Esta serie de reacciones le permitieron analizar las proteínas de forma secuencial,aminoácido por aminoácido, y así preservar la información lineal estructurales necesarias para interpretar su actividad biológica.

El procedimiento de la degradación de Edman o secuenciación de Edman marca y elimina sólo el residuo N-terminal de un polipéptido, dejando el resto de enlaces peptídicos intactos. Para ello, se hace reaccionar el péptido con PITC eliminándose el residuo N-terminal en forma de derivado de fenilhidantoína (PTH). Después de la eliminación e identificación del residuo N-terminal mediante HPLC, el nuevo residuo N-terminal puede ser marcado, eliminado e identificado por repetición de la misma serie de reacciones. Este procedimiento se repite hasta que se ha determinado toda la secuencia.

Esquema de la Secuenciación de Edman

Edman ideó en la Universidad de Lund las condiciones de reacción adecuadas para todos los aminoácidos y la gran mayoría de las clases de proteínas además de minimizar el número de reacciones secundarias no deseadas.

Debido a que se tienen que realizar muchos pasos de reacción y muchas determinaciones, normalmente hoy día éste método se lleva a cabo mediante analizadores automáticos o secuenciadores que mezclan los reactivos en las proporciones adecuadas, separa los productos, los identifica y registra los resultados. Visionario en su campo, Edman diseñó en 1961 un instrumento automático llamado “secuenciador de proteína para determinar la estructura de las proteínas mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos”, el primer secuenciador automatizado de proteínas.

Edman continuó hasta su muerte trabajando para mejorar este método y así poder determinar cadenas más largas pero con menor material de partida.

Este Post participa en la VI edición del Carnaval de Biología, albergado por Copépodo en su blog Diario de un Copépodo.

Mapas de proteínas

Comenzamos con este artículo ya a entrar en materia y dejamos atrás los artículos básicos sobre aminoácidos, enlaces peptídicos y estructura de proteínas.

En el análisis global de los componentes de un proteoma nos podemos encontrar a grandes rasgos con dos estrategias:

a) Convencional: separar todas las proteínas de la muestra (por electroforesis en dos dimensiones en general) e identificar aquellas de interés por espectrometría de masas.

b) A gran escala (“shot-gun”): la muestra es tratada con una enzima proteolítica y los péptidos resultantes se separan por HPLC acoplada a un sistema de espectrometría de masas. Esto permite la identificación de todas las proteínas presentes en la mezcla.

En este post vamos a ver la primera de ellas, la estrategia convencional, la cual se basa en el empleo de la electroforesis bidimensional.

La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución para separar mezclas de proteínas muy complejas. La base de su gran poder de resolución es la bidimensionalidad, es decir, que las proteínas son separadas ortogonalmente al aplicar dos métodos físicos distintos. Una primera dimensión separa las proteínas en un gel de acrilamida con gradiente de pH por su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque, del inglés isoelectric focusing IEF). En la segunda dimensión las proteínas son separadas por su masa molecular por electroforesis en poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras teñir el gel, las proteínas aparecen como manchas circulares. (www.bioinformatica.uab.es).

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al que su carga neta es cero, por lo que no se desplaza en un campo eléctrico. Al introducir una mezcla de proteínas en un gel con un gradiente de pH, sus extremos N y C terminal (recordadlo en este post) y sus residuos ionizables captan o liberan protones de acuerdo con el pH, por lo que su carga eléctrica global dependerá del pH del entorno. Al aplicar un campo eléctrico, todas las moléculas con carga neta positiva serán atraídas hacia el cátodo, y aquellas con carga neta negativa hacia el ánodo. A medida que las moléculas de proteína se acercan a su pI van perdiendo carga eléctrica, hasta llegar al valor de pH en que su carga neta sea cero y dejen de moverse. Se dice entonces que las proteínas han enfocado, pues todas las moléculas de una proteína inicialmente dispersas por todo el gradiente de pH se han concentrado en un solo punto, que corresponde a su pI; de aquí el nombre de IEF. El enfoque se realiza a voltajes muy altos, de hasta 10000V, y en condiciones desnaturalizantes (ej. 8M urea) para obtener la máxima resolución.

En sus inicios, a finales de los 70, estos gradientes de pH se generaban con una mezcla compleja de pequeños polímeros con gran capacidad tampón cerca de su pI, o carrier ampholytes (CA), aunque tenían problemas como distorsión del gradiente de pH, variabilidad entre geles y gran complejidad química. Hoy, los anfolitos han sido sustituidos por las tiras IPG (gradientes de pH inmovilizados en un soporte plástico) generados por la copolimerización, junto a acrilamida y bisacrilamida, de un gradiente de monómeros de acrilamida derivatizados con grupos ácidos o básicos cuya unión covalente a la matriz impide la distorsión del gradiente. Las tiras IPG tienen muchas ventajas: i) tolerancia a presencia de sales en la muestra, ii) mayor capacidad de carga, iii) numerosos gradientes de pH (incluso muy estrechos, de <1 unidad), iv) gran disponibilidad comercial (GEHealthcare, Bio-Rad Laboratories).

La segunda dimensión consiste en una separación SDS-PAGE convencional. La tira IPG se deposita sobre el gel SDS-PAGE y se lleva a cabo la electroforesis.

Esquema de una electroforesis bidimensional (2-DE)

Tras realizar la segunda dimensión hay que teñir los geles. Hay muchos métodos de tinción de proteínas en geles de poliacrilamida pero sólo algunos se usan en 2-DE. El más usado durante muchos años ha sido la tinción con plata, por su alta sensibilidad, pues revela menos de 1 ng de proteína. Sin embargo, la plata no es una tinción a punto final y su rango lineal es muy estrecho. Por ello, ha sido sustituido por métodos de tinción con colorantes fluorescentes como el Sypro Ruby que, aunque mucho más caros, tienen una sensibilidad comparable a la de la plata y un rango dinámico lineal de hasta tres órdenes de magnitud, óptimos para estudios cuantitativos.

Como desarrollo de la 2-DE ha surgido una nueva tecnología que saca todo el provecho de la 2-DE y la tinción con fluoróforos: la técnica DIGE (Difference Gel Electrophoresis). Esta técnica corrige los problemas de reproducibilidad, detección de manchas y posterior análisis de la 2-DE convencional. Se basa en las propiedades de 3 tipos de fluoróforos de la familia de las cianinas (CyDye: Cy3, Cy2, Cy5), que emiten luz a distinta longitud de onda. Cada muestra se marca con uno de ellos y, tras el marcaje, se mezclan antes del isoelectroenfoque; se separan hasta 3 muestras diferentes (2 problema y 1 control generado al mezclar ambas, ó control interno) en un sólo gel, eliminándose la variación entre geles y asegurando que los efectos de sobre/sub-expresión visualizados en el gel se deben sólo a cambios biológicos. Así, cada mancha de proteína puede ser comparada fácilmente en distintas condiciones de manera semicuantitativa.

Esquema de un experimento con técnica DIGE

Al final de todo el proceso de la electroforesis bidimensional vamos a obtener unos mapas de las proteínas que se estaban expresando en un determinado momento en el organismo/tejido/cultivo tan chulos como este que os muestro a continuación y que obtuvo el que os escribe durante el desarrollo de su Tesis Doctoral:

Mapa proteico real

Y aquí es donde comienza el trabajo de espectrometría de masas y bioinformática, pero eso ya es otra historia que os contaré otro día…