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SRM: La validación de resultados del siglo XXI

Hola de nuevo a todos, después de tanto tiempo, vuelvo a escribir un nuevo post.

Esta vez se lo dedico a una persona a la que admiro en divulgación científica. De hecho este año ha ganado el bitácoras en el apartado ciencia. Se trata de Jose, @scientiaJMLN, al cual, si no seguís tanto en su blog como en twitter ya os digo que estáis tardando. Jose, va por tí maestro!

Al grano, pues… Ya sabéis por el post anterior lo bien que me llevo con el Western Blot.  Puede considerarse que el Western es para mi un archienemigo tipo Spiderman-Duende Verde, Sauron en el Señor de los Anillos, o cualquier super malo que se os ocurra.

Aun a pesar de todos los pesares, esta técnica se sigue utilizando a día de hoy como “estándar” para validación de resultados observados en los experimentos que realizamos los pocos locos que seguimos en España haciendo investigación. Ésta técnica como deberíais saber ya, es de los años 70, una época un poco lejana. Pero se sigue utilizando… y diréis todos ¿por qué? ¿No se ha avanzado nada desde esa fecha? Eso digo yo… y como buenos lectores que sois, os voy a explicar una técnica que puede servir (y de hecho bajo mi punto de vista ya debería ser estándar) para realizar el trabajo del Western más barato, más rápido, más específico y lo mejor de todo, de forma cuantitativa, no semicuantitativa como en el caso de mi archienemigo…

La técnica de la que os voy a hablar hoy es el SRM (Selected Reaction Monitoring). Se trata a grandes rasgos de poner un espectrómetro de masas a buscar y cuantificar una o varias proteínas de forma específica en una muestra donde tenemos varios miles de proteínas diferentes.

¡Ah! ¡Muy bien! Seguro que es súper fácil… diréis. Bueno, fácil no es. Ese es el concepto, lo que hay detrás es algo más complicado y es lo que quiero que a grandes rasgos entendáis para que al próximo que os presente al Western como herramienta de validación le déis en los morros con argumentos.

Empecemos. SRM, Selected Reaction Monitoring. Todos sabéis a estas alturas que las proteínas están compuestas por una secuencia de aminoácidos. Esas secuencias de aminoácidos son únicas para cada una de las proteínas que existen. La secuencia de una proteína puede ser “cortada” o digerida con determinadas enzimas (Leed esto). A partir de una digestión tríptica (esto es, con tripsina), la secuencia de aminoácidos de una proteína va a cortarse entre los aminoácidos Arginina y Lisina. De esta forma vamos a obtener una serie de fragmentos denominados péptidos los cuales, gracias a las características de esta enzima, van a ser digamos “estables” en diferentes muestras. Es decir, la tripsina siempre va a cortar en K-R (excepto si a K o R le sigue una P (prolina)), por lo que los péptidos obtenidos siempre van a ser los mismos aunque tengamos diferentes condiciones experimentales. Una vez que tenemos los péptidos de las proteínas, nos interesa conocer los niveles de expresión (o cantidad) de una o varias en concreto. ¿Cómo lo conseguimos? Pues seleccionando aquellos péptidos característicos de una proteína y cuya secuencia solo sea característica de esa proteína. Ese es el primer paso.

Resumiendo, tenemos una proteína cuya expresión queremos medir. Sabemos su secuencia, y la digerimos con tripsina para obtener péptidos de la misma. El péptido o péptidos con secuencia única y característica de esa proteína es lo que buscamos. Ahora quedaría otro paso más…

Normalmente, en un laboratorio de proteómica, se utiliza LC-MS para SRM (se puede hacer también con un Maldi, pero eso es otra cuestión que no viene al caso). Con LC-MS quiero decir que es una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. 

El principal problema que vamos a encontrarnos si medimos con la premisa anterior una proteína es que cuando hagamos la cromatografía líquida, nuestro péptido de interés, el que caracteriza nuestra proteína, va a co-eluir junto a otros péptidos de secuencia diferente pero con la misma hidrofobicidad (se hace normalmente una fase reversa) y lo notaremos principalmente en su relación masa/carga, que es lo que vemos en el masas. Si esto ocurre, no podremos medir nuestra proteína de manera específica, ya que la señal que vamos a obtener va a estar “falseada” con los otros péptidos que no queremos medir. ¿Como solucionar esto y elegir solamente nuestro péptido y medir nuestra proteína? Pues volviendo a seleccionar otra característica de los péptidos: las transiciones o fragmentos originados con un espectrómetro de masas a partir de nuestro péptido de interés.

En los masas, como el triple cuadrupolo, una de sus “cámaras” puede utilizarse como celda de colisión de manera que el instrumento rompe los péptidos que entran en él en diferentes subfragmentos. No voy a entrar en como lo hace.

La cuestión es que esto lo vamos a utilizar de la siguiente forma: aplicamos un primer filtro en la primera fase de masas en la que seleccionamos la masa/carga (m/z) de nuestro péptido específico y con el cual pueden llegar a entrar algunos péptidos que nos den “ruido”. Después pasamos esos péptidos con esa m/z a la celda de colisión donde los fragmentamos y en una segunda fase de masas (MS2) seleccionamos la m/z de aquellos fragmentos (transiciones) que sabemos que vienen de nuestro péptido de interés y ya medimos de forma muy específica lo que queremos: nuestra proteína.

Todo eso os lo resumo en la siguiente figura (Fuente Kinter et al 2013):

Imagen

Como véis el flujo es sencillo: tenemos 3 péptidos entrando en el masas. El péptido A (el que nos interesa) tiene una m/z (masa/carga) de 370, por lo que ponemos el espectrómetro a seleccionar esa masa en la primera fase (MS1) de forma que solo nos dejará pasar a la siguiente fase los péptidos que tienen esa m/z. Con esto ya nos quitamos el péptido C, pero sin embargo, tenemos al péptido B que nos daría “ruido” en la medición de nuestra proteína.

Para ello pasamos todos los péptidos de m/z 370 a la celda de colisión y de todos los fragmentos generados solamente seleccionamos en una segunda fase (MS2) aquellos que provengan de nuestro péptido de interés (en azul) y más señal nos den y descartamos el resto. Así nos quitamos de enmedio el ruido provocado por el péptido B y sus fragmentos y fragmentos de nuestro péptido de interés que no nos sean útiles.

Todo este proceso se diseña en laboratorio bajo supervisión y no es tan sencillo como os lo explico aquí ya que hay que tener en cuenta multitud de factores, pero bueno, por lo menos así ya tenéis un arma más para matar a mi archienemigo.

¿Ventajas? Pues muchísimas: especificidad, cuantificación absoluta (no relativa como el Western), no se depende de una reacción de un anticuerpo, podemos medir hasta 100 proteínas (cuantificarlas, vamos) en un solo pase… etc, etc. Por no hablar de dinero, una cosa muy importante en tiempos de crisis. Creo que así a ojímetro, tras poner a punto el método puedes reducir los costes a una quinta parte de lo que cuesta un Western en igualdad de condiciones y además puedes hacer las mediciones más rápido, en cuestión de minutos.

Y lo mejor: una vez que diseñas el método de SRM te va a servir para toda la vida. Siempre es lo mismo. Y ya hay bases de datos en constante crecimiento donde los locos como yo vamos depositando esos métodos para que la comunidad científica los tenga a mano.

Espero que os haya entretenido aunque sea un rato ;-P

 

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Es la hora…

Bugs

Jejejeje, que hay de nuevo viejo…

Maldito! Cuanto tiempo sin saber de tí y de tus actualizaciones de blog…

Cosas de la vida… querido visitante… te cuento…

Tras mi salida del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Córdoba (cuanto me acuerdo de vosotros!), me he embarcado en una aventura en la que por ahora me encuentro cómodo, contento y porqué no decirlo, feliz. Entré en el IMIBIC hace ya unos meses y tras un inicio bastante estresante y un poco perdido (como cualquiera que empieza en un nuevo trabajo) ya me he habituado al nuevo ritmo de trabajo, que podría definirse como frenético, pero a la vez gratificante conforme vas viendo los frutos de tu trabajo.

Además, estoy aprendiendo un montón de cosas junto a mis nuevos compañeros, tanto los de las oficinas como los del edificio de Experimentación. ¡Qué manera de complicarse la vida tienen algunos! Eso sí… luego les salen unos experimentos que te quedas mudo…

También he iniciado una pequeña estancia en mi segunda casa en la UCO: la Unidad de Proteómica del SCAI. Allí estoy empezando a dar servicio al personal. Aprendiendo a gestionar una unidad, a realizar tratamiento de preparación de muestras, a manejar los distintos instrumentos que tienen allí disponibles… vamos, es como soltar a un crío en un chikipark de esos… me lo paso teta allí (pero trabajo duro, eh? que os creéis).

Bueno al grano, hoy el post va a ser cortito. Pienso darle un nuevo aire al blog e iré publicando de vez en cuando, a ver si me obligo porque si no @ScientiaJMLN, @bioamara, @lualnu10 y demás amiguetes de twitter y la blogosfera me van a matar (Os quiero chavales! Ya sabéis que os sigo en la sombra cuando puedo…). Mi objetivo en principio va a ser publicar comentarios acerca de artículos de interés que haya leído recientemente en Proteómica para que conozcáis que se cuece de primera mano en el frente de batalla y en perfecto cristiano. Nada de términos técnicos. Bueno, algunos sí, que ya están explicados en el blog y los voy a dar por sabidos.

Pues nada más, espero seguir por aquí todo lo que pueda molestando al personal. Para los que queráis más información de donde estoy trabajando y que es lo que podemos hacer os recomiendo una visita a la página del IMIBIC y a la de las UCAIB.

Un saludo y nos vemos pronto!

Nosotros también tenemos colores

Mis colegas que trabajan en Biología Celular tienen unas de las aplicaciones de proteínas más chulas y que más me han fascinado desde que entré en este inmenso mundo que es la Ciencia. Os confieso que la primera vez que pude ver una cosa así en directo en un microscopio confocal me quedé literalmente sin palabras y entendí la de vueltas que llegamos a darle a las cosas los científicos con tal de realizar experimentos útiles.

Gato con el gen de GFP insertado. Fuente: Xatakaciencia

Efectivamente, os hablo de las proteínas fluorescentes. Ellos utilizan generalmente tres tipos de proteínas (GFP, YFP y RFP) para poder ver “in vivo” los acontecimientos que están ocurriendo en la célula y que son de su interés. Recientemente habéis podido ver su utilidad para poder observar el desarrollo de una enfermedad similar al SIDA en gatos tal y como podéis ver arriba.

Pero espera… ¿que es GFP, YFP, RFP? Son los acrónimos de Green Fluorescent Protein (GFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP) y Red Fluorescent Protein (RFP).

La GFP es una proteína que produce de forma natural la medusa Aequorea victoria. Esta proteína está constituida por 238 aminoácidos, los cuales forman once cadenas beta consecutivas que forman un cilindro en cuyo centro se encuentra una hélice alfa (espero que a estas alturas ya os hayáis leído la entrada de estructura del blog).

Estructura de la GFP. Fuente: Wikipedia

Esta proteína emite luz en la zona verde del espectro visible, por eso la vemos de color verde cuando iluminamos la célula/tejido/organismo con luz ultravioleta.

Esta proteína bioluminiscente se ha convertido en una herramienta clave en muchos de los experimentos de Biología Molecular y Celular desde hace varios años y nos ha permitido observar la expresión de genes y otras moléculas dentro de células u organismos completos. Las aplicaciones de la GFP son innumerables.

Como siempre, detrás de un gran descubrimiento suele haber grandes científicos que lo han llevado a cabo. De hecho, el descubrimiento, caracterización y aplicación de la GFP fueron el motivo por el que los estadounidenses Martin Chalfie y Roger Tsien y el japonés Osamu Shimomura compartieran el Premio Nobel de Química en 2008.

Osamu Shimomura fue la primera persona en aislar la GFP a partir de la Aequorea victoria e identificar qué parte era responsable de la fluorescencia. Martin Chalfie supo cómo utilizar la GFP para visualizar procesos en Biología Celular y por último, Roger Tsien, diseñó nuevas variantes de la GFP que brillan en distintos colores (YFP, RFP). Si queréis más información sobre aplicaciones que utilizan este tipo de proteínas no os olvidéis de visitar esta entrada del blog Jindetrés sal! del genial @DrLitos.

Utilización de diferentes proteínas fluorescentes en el marcaje de distintos compartimentos celulares. Fuente: Nikon

Es más,  si lo que realmente queréis es la máxima información en profundidad acerca de la cantidad de variantes que existen y las propiedades de estas proteínas tan especiales os recomiendo este enlace (en inglés).

Pero no solo los chicos pijos de Biología Celular tienen colores para “jugar”… En clase, también los tenemos los proteómicos, aunque utilizando una aproximación un poco diferente.

En este caso os voy a explicar como conseguimos nosotros los colores con los que jugar. En definitiva se trata de añadirle a cada una de las muestras que estemos analizando el color que queremos.

Los proteómicos utilizamos para “teñir” las muestras (las proteínas) unos grupos químicos denominados cianinas que podemos unir a las lisinas que tienen las proteínas que estamos analizando.

La técnica con la que conseguimos los colores tiene como nombre DIGE (Differential In Gel Electrophoresis) y corrige los problemas de reproducibilidad, detección de manchas y posterior análisis de la 2-DE convencional. Se basa en las propiedades de 3 tipos de fluoróforos de la familia de las cianinas (CyDye: Cy3, Cy2, Cy5), que emiten luz a distinta longitud de onda.

Normalmente, los reactivos comerciales que se utilizan tienen un grupo reactivo (éster NHS) y están diseñados para formar un enlace covalente con el grupo amino (epsilon) de los aminoácidos de lisina de las proteínas vía unión amida. El fluoróforo añadido a la proteína de esta forma no nos va a varíar el pH de la proteína pero incrementa el tamaño de la misma sólo un poco y por eso se tiene en cuenta a la hora de analizar.

Bien, como os digo, cada muestra se marca con uno de los fluoróforos y, tras el marcaje, se mezclan antes del isoelectroenfoque. De esta forma se separan hasta 3 muestras diferentes (2 problema y 1 control generado al mezclar ambas, ó control interno) en un sólo gel, eliminándose la variación entre geles y asegurando que los efectos de sobre/sub-expresión visualizados en el gel se deben sólo a cambios biológicos. Así, cada mancha de proteína puede ser comparada fácilmente en distintas condiciones de manera semicuantitativa.

Esquema de un experimento DIGE clásico (Fuente: GEHealthcare)

Después de haber realizado la segunda dimensión de la electroforesis los geles con las 3 muestras se digitalizan mediante el uso de un escáner láser que excita a cada cianina en su longitud de onda correspondiente. Así obtenemos de cada gel 3 imágenes como estas:

Imagenes de un experimento DIGE obtenidas con un escáner láser. Fuente: Ludesi

Y una vez que se han obtenido nuestras muestras coloreadas podemos analizarlo mediante un software específico para ello y así poder comprobar que proteínas varían su expresión dependiendo de cada una de las muestras. Es tras el análisis cuando las escindiremos del gel y las analizaremos mediante espectrometría de masas.

Bienvenidos

Querido visitante,

Hola, sé bienvenid@ a este blog dedicado a proteínas y proteómica en general.

El objetivo de este blog (del que lo escribe al menos) es difundir de una manera más amena y comprensible este pequeño campo de la Bioquímica, la Proteómica.

Al ser mi primer blog, seguro que entenderás que tenga al principio algunos fallos ya que nadie nace sabiendo, pero quiero que sepas que intentaré poner todo mi empeño en que cuando abandones esta página salgas con algo nuevo conocido, te plantees nuevas preguntas y tengas más necesidad de conocer acerca de Proteómica.

Pues nada más, empezamos pues esta nueva aventura… a ver por qué aguas nos lleva.

Un saludo y gracias!