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Algo de la historia de la Proteómica

Secuenciación de Edman

Volviendo la mirada hacia las entradas del blog, me he dado cuenta de que hay algunas cosas que asumo como que ya las conocéis y puede ser que no sea así. Por eso hoy vamos a explicar brevemente, o lo más brevemente posible como fue el origen de la secuenciación de las proteínas.

La secuenciación de proteínas fue (según mi humilde opinión) uno de los hitos históricos a tener en cuenta para las personas que trabajamos con las mismas ya que sin ella (y varias cosas más),  probablemente no tendríamos Proteómica…

Pehr Victor Edman

Todo comienza con la labor de un joven científico llamado Pehr Victor Edman. En aquellas fechas se acababa de reconocer que las proteínas eran entidades con una estructura, una masa y una carga eléctrica definidas. Este hombre, como muchos de nosotros, se encontraba centrado en investigación básica en Estocolmo, en el Instituto Karolinska, haciendo su trabajo para su tesis doctoral cuando se le cruzó en medio una guerra. Era una época muy dura, y tras servir en el ejército sueco durante la Segunda Guerra Mundial continuó sus trabajos y en 1947 le concedieron un premio para ir al Rockefeller Institute of Medical Research en la prestigiosa Universidad de Princeton donde realizó sus trabajos de purificación y caracterización de la Angiotensina de sangre bovina.

En aquellos años colegas físico-químicos suecos habían descubierto que proteínas de diferentes tamaños moleculares poseían estructuras químicas específicas y más que probablemente individuales.Edman estaba muy interesado en la determinación detallada de la estructura de las proteínas y  con su método consiguió dar lugar a una explicación estructural de sus diversas actividades biológicas.

Para su doctorado, Edman aisló de la sangre bovina una proteína pequeña que regula la presión arterial (Angiotensina), pero pronto se dio cuenta de que las proteínas están constituidas por pequeños “bloques o ladrillos”: los aminoácidos. Para dar una explicación estructural a las diversas actividades biológicas de las proteínas debía encontrar un método que le permitiera una determinación de la estructura de las mismas.

A Edman se le ocurrió la fantástica idea de una serie de reacciones basadas en el acoplamiento del fenilisotiocianato (PITC) con una proteína purificada y el uso de hidrólisis ácida. Esta serie de reacciones le permitieron analizar las proteínas de forma secuencial,aminoácido por aminoácido, y así preservar la información lineal estructurales necesarias para interpretar su actividad biológica.

El procedimiento de la degradación de Edman o secuenciación de Edman marca y elimina sólo el residuo N-terminal de un polipéptido, dejando el resto de enlaces peptídicos intactos. Para ello, se hace reaccionar el péptido con PITC eliminándose el residuo N-terminal en forma de derivado de fenilhidantoína (PTH). Después de la eliminación e identificación del residuo N-terminal mediante HPLC, el nuevo residuo N-terminal puede ser marcado, eliminado e identificado por repetición de la misma serie de reacciones. Este procedimiento se repite hasta que se ha determinado toda la secuencia.

Esquema de la Secuenciación de Edman

Edman ideó en la Universidad de Lund las condiciones de reacción adecuadas para todos los aminoácidos y la gran mayoría de las clases de proteínas además de minimizar el número de reacciones secundarias no deseadas.

Debido a que se tienen que realizar muchos pasos de reacción y muchas determinaciones, normalmente hoy día éste método se lleva a cabo mediante analizadores automáticos o secuenciadores que mezclan los reactivos en las proporciones adecuadas, separa los productos, los identifica y registra los resultados. Visionario en su campo, Edman diseñó en 1961 un instrumento automático llamado “secuenciador de proteína para determinar la estructura de las proteínas mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos”, el primer secuenciador automatizado de proteínas.

Edman continuó hasta su muerte trabajando para mejorar este método y así poder determinar cadenas más largas pero con menor material de partida.

Este Post participa en la VI edición del Carnaval de Biología, albergado por Copépodo en su blog Diario de un Copépodo.

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El experimento de Anfinsen

Andaba el otro día hablando con una compañera de trabajo sobre lo desastre que somos los alumnos haciendo prácticas en una de las asignaturas que impartimos aquí en la Universidad.

Resulta que todavía tenía guardados los “cuadernos de laboratorio” que se elaboraban en esas prácticas de la asignatura “Metodología en Bioquímica” y estuvimos echándonos unas risas cuando le pedí que me devolviese el mío. Pero se negó en rotundo hasta que no finalice de impartirse la asignatura el año que viene (desaparece por la implantación del nuevo plan de estudios).

La cosa es que yo, por aquel entonces, como buen estudiante, hice caso al pie de la letra a “mis profes” que nos dijeron que no hacía falta pasar a limpio aquel cuaderno en cuestión. El resultado, como podéis imaginar, fue un cuaderno “digno de enmarcar” según una de las que ahora son mis compañeras de trabajo. Totalmente desastroso, con borrones por todos lados, etc, etc… en fin, un cuaderno de laboratorio de los que daba pánico ver (según recuerdo).

También salió dentro de la conversación una pregunta que nos hizo el que ahora es mi jefe a los alumnos. Os pongo en situación:

Dos cachondos mentales, mi amiguete Carlos y el que os escribe, estando a lo suyo, vamos a no hacer nada en las prácticas y echarse unas risas durante aquellas tardes, andaban digamos… algo despistados y no se dieron cuenta de que entró el profesor en el laboratorio. El profesor, ante la dejadez de estos dos tipejos, va y le espeta a uno de ellos: “A ver, tú (Carlos), dime en qué consistió el experimento de Anfinsen” a lo que el alumno (repito, un cachondo mental) responde: “Pues mira, pues ahora mismo no lo sé pero si quieres te puedo decir la hora….”.

Si señor!, con dos cojones! Yo me quedé azul, violeta, rojo y me puse de todos los colores al escuchar la respuesta porque no sabía donde me iba a meter!!!

El profesor, ni corto ni perezoso dijo: “Ah, un graciosillo en la clase, no? Pues mañana todos ustedes gracias a este gracioso me tendrán que responder a la pregunta que le he hecho”.

La verdad es que en el momento creímos todos los que estábamos en las prácticas que nos habíamos librado de una buena pero al día siguiente volvió y tuvimos que responder a todo tipo de preguntas tanto relacionadas con el experimento de Anfinsen como relacionadas con lo que estábamos haciendo durante esas prácticas y creo que eso nos llevó tanto a mi amiguete como a mi a tener digamos… una nota un poco más baja que la del resto (por graciosillos) o fue eso, o bien el profesor seguro que me tenía manía (mentira, luego entramos los dos a trabajar con él en su laboratorio al cabo de dos años, XD).

Bien, tras todo este rollazo de anécdota, os voy a contar quién fue Anfinsen y en que consiste el experimento por el que me preguntó mi profesor, el cual os aseguro, no se me ha olvidado nunca y de hecho, siempre que lo recuerdo me hace sonreir.

C.B. Anfinsen (fuente: Wikipedia.org)Christian Boehmer Anfinsen, Anfinsen para los colegas,  fue un bioquímico estadounidense que demostró parte de lo que venimos hablando en las anteriores entradas.

Al principio se pensaba que la desnaturalización y pérdida de función en las proteínas era irreversible. Anfinsen, dispuesto a demostrar lo contrario, hizo diferentes experimentos con una pequeña proteína que se llama ribonucleasa.

Esta proteína está formada por 120 aminoácidos y a lo largo de su secuencia hay 8 cisteínas (Cys), las cuales que pueden formar 4 enlaces disulfuro.

Durante el experimento, Anfinsen sometió a la ribonucleasa a una disolución de  urea 8 M y beta-mercaptoetanol, que hizo que la proteína se desplegase por completo perdiendo su actividad (cuando digo actividad me refiero a la función que desempeña).

Ribonucleasa. Fuente: wikipedia.org

Pero pudo observar que si eliminaba la urea y el beta-mercaptoetanol, la ribonucleasa recuperaba toda su actividad, lo que implica que los puentes de hidrógeno y los puentes disulfuro de las estructuras secundarias y terciarias se volvieron a formar.

Gracias a esta observación pudo concluir que:

1. El plegamiento es espontáneo y es termodinámicamente favorable.

2. La información sobre el plegamiento reside sólo en la cadena lineal, o lo que es lo mismo, la configuración estructural de una proteína es una información que se encuentra codificada en la estructura primaria de una proteína.

Fijaos si fue importante el descubrimiento que en 1972, gracias a este experimento y sus estudios sobre la ribonucleasa (el experimento base que os cuento en realidad es parte de varios), le concedieron el Nobel.

Hoy en día, se sabe que esto ocurre sólo en ciertas ocasiones, ya que el plegamiento no viene sólamente determinado por la estructura primaria de una proteína, sino que este viene determinado también por la presencia de otras proteínas como las chaperonas, pH, temperatura, etc.