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Cosas básicas que saber

Digestiones e ionizaciones en el laboratorio

Antes de empezar con la serie de artículos interesantes creo que es necesario que sepáis algunos conceptos básicos que ocurren en el laboratorio antes de pasar a utilizar el espectrómetro de masas, como son la digestión y un par de tipos básicos de ionización.

Digestión

¿En que consiste exactamente una digestión cuando estamos en proteómica? Como sabéis las proteínas están hechas de una serie de piezas tal y como os puse en un post anterior. Cuando lo que queremos es identificarlas y saber la secuencia exacta en la que los aminoácidos están presentes en esa proteína utilizamos un espectrómetro de masas o secuenciación de Edman.

Actualmente, en proteómica tanto basada en geles como en líquido, se suele “cortar” esas proteínas en trozos más pequeños denominados péptidos para que el espectrómetro de masas que estemos utilizando sea capaz de darnos la secuencia de los mismos. De esta forma podemos saber rápidamente la secuencia o deducirla y podemos llegar a identificar la proteína o las proteínas en cuestión de minutos. Para ello comparamos las secuencias obtenidas con las bases de datos públicas disponibles en la red, siendo Uniprot una de las más utilizadas (bajo mi punto de vista, la mejor).

Tripsina (Fuente: RCSB)

Tripsina (Fuente: RCSB)

Vale, todo esto está muy bien… ¿pero como se hace una digestión? En proteómica utilizamos una especie de “tijeras moleculares”, unas enzimas (de la familia de las proteasas) las cuales están perfectamente caracterizadas tras años de estudio y de las cuales sabemos perfectamente su comportamiento.

La reina indiscutible para estos menesteres en proteómica es la tripsina. Esta enzima (que no encima, eso es arriba), rompe los enlaces peptídicos mediante una reacción de hidrólisis y se forman péptidos y aminoácidos a partir de una proteína completa. Normalmente la tripsina se produce de forma general en muchas células incluyendo entre sus localizaciones el cristalino, leucocitos, eritrocitos, piel, parótida, riñón e hipófisis, aunque es producida mayoritariamente en el páncreas y secretada en el digestivo a nivel del duodeno donde es esencial para la digestión que todos hacemos todos los días.

Esta proteína se puede purificar a partir de extractos de páncreas de cerdo y se compra comercialmente en casas especializadas en este tipo de productos (no, no voy a hacer publicidad gratuita, el que quiera saber alguna referencia que me pregunte, no hay problema 😉 ).

Bien, ya hemos hecho trizas nuestra proteína y la tenemos cortadita y picadita como si fuese un puerro, en juliana… Ahora toca prepararla para su análisis mediante espectrometría de masas.

Hago un pequeño paréntesis: normalmente la preparación de la muestra tanto antes de la digestión como después de la misma es un paso crítico para la obtención de unos resultados como Dios manda. Os lo recuerdo por si acaso no lo sabíais. Es más, una mala preparación pre-digestión o post-digestión os puede condenar al desastre en vuestro experimento si no lo habéis hecho con el máximo cuidado y esmero. Como responsable de un servicio de proteómica os digo que llega cada cosa a los servicios que os pondría los pelos de punta. Por favor, cuidad vuestras muestras. Intentad ser lo más cuidadosos posible y entregad las mismas a los servicios de proteómica en unas condiciones óptimas. De vuestro trabajo dependen en la mayoría de las ocasiones unos buenos resultados.

Columna de fase reversa C18. Observad la punta de la pipeta: esa cosita blanca que hay ahí es la resina donde se inmobilizan los péptidos

Columna de fase reversa C18. Observad la punta de la pipeta: esa cosita blanca que hay ahí es la resina donde se inmobilizan los péptidos

En fin, como os decía, tras la digestión, estas muestras suelen limpiarse tanto de restos de gel en su caso como de sales mediante la utilización de columnas de fase reversa,normalmente inmovilizadas en la punta de una micropipeta. Una columna no es más que una resina sintética que se coloca sobre esa punta de pipeta como si fuese una especie de filtro. La muestra (ya convertida en péptidos y aminoácidos) se pasa a través de esa columna, se retiene allí (interacciona con la resina) y se le pasan varias veces una serie de tampones para limpiar las sales y finalmente, se suelen eluir en un tampón compatible con nuestra fuente de ionización, dependiendo del espectrómetro de masas a utilizar, etc.

Fuentes de Ionización

En Proteómica se suelen utilizar principalmente fuentes de ionización bastante suaves. Yo os voy a hablar de la fuente de ionización tipo MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) que en cristiano viene a ser algo así como desorción/ionización láser asistida mediante matriz, y de la ionización tipo ESI (Electrospray Ionization).

Normalmente la fuente tipo MALDI se utiliza off-line, es decir, el espectrómetro que la utiliza no tiene ningún equipo asociado que permita el análisis continuado de muestra, como sí ocurre con la fuente tipo ESI, que es más común en espectrómetros de masas que tienen en cabecera on-line un nanoHPLC normalmente, lo que permite un análisis contínuo de muestra.

Placa MALDI donde se cocristalizan las muestras y la matriz

Placa MALDI donde se cocristalizan las muestras y la matriz

Mi especialidad es el MALDI, como os ireis dando cuenta con el tiempo. Este tipo de ionización se suele montar en un espectrómetro de masas que tiene como analizador un TOF o un TOF/TOF. No, no estoy tosiendo, jejejejeje. TOF significa Time Of Flight y lo que hace este tipo de analizador es separar las muestras que le entran mediante su relación masa/carga respecto al tiempo que tardan en recorrerlo. Pero bueno, ahora mismo esto no viene al caso, centrémonos en las fuentes de ionización.

La fuente MALDI consiste básicamente en lo siguiente: las muestras son coprecipitadas con una matriz, es decir, una sustancia usada para inmovilizar la muestra en un soporte metálico y que permitirá ionizar la muestra. El sólido resultante sobre el soporte se irradia con pulsos de láser con longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (normalmente láseres de N2 que emiten a 337 nm).

La matriz que se suele usar es casi siempre una molécula orgánica pequeña cuya absorbancia se encuentra dentro de la longitud de onda del láser que se esté usando. Las matrices difieren en la cantidad de energía que donan a las biomoléculas durante el proceso de desorción e ionización. El trabajo con biomoléculas casi siempre se realiza usando como matrices bien ácido α-ciano-4-hidroxicinnámico (CHCA) o bien ácido dihidrobenzoico (DHB).

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI (Fuente: www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI (Fuente: http://www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización ESI (Fuente:www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización ESI (Fuente: http://www.magnet.fsu.edu)

Con respecto a la fuente de ionización tipo ESI os diré que este método de ionización usa una aguja a cuyo través se bombean flujos muy reducidos de una disolución (nanolitros de una mezcla entre orgánico y agua, como metanol:agua, 50:50) con el analito disuelto. En su punta se aplica un voltaje muy alto por lo que el fluido se dispersa electrostáticamente en pequeñas gotas que se evaporan y dan su carga a las moléculas de analito que se ionizan a presión atmosférica. Para estabilizar el spray producido se suele usar un gas inerte. Una vez ionizado y estabilizado el spray, las moléculas de analito se transfieren al espectrómetro de masas con muy alta eficiencia.

Una vez ionizadas las moléculas de nuestra muestra, estas entran en los analizadores de los espectrómetros de masas que estemos utilizando, pero eso amigos míos, es otra historia que os contaré en otra ocasión.

Esta entrada participa en el XX Carnaval de Química organizado por @bioamara en su blog La ciencia de Amara.

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Hágase la luz

La luz… Una dualidad onda/corpúsculo que lleva con nosotros desde el comienzo de los tiempos… Y que también sirve, como no, para realizar análisis en Proteómica.
Así a bote pronto se me ha ocurrido explicaros 3 aplicaciones cotidianas en todo laboratorio de Proteomica que se precie que usan la luz como método de análisis o como parte de un análisis.

Luz láser. Fuente

La primera de estas técnicas es una de las mas citadas por todos los artículos proteómicos: la técnica de Bradford.

Esta técnica sirve para medir la cantidad de proteína presente en una muestra. Sí, lo se, lo se, hay mas métodos (por ejemplo, el método de Lowry)  pero al fin y al cabo todos basan su medida final en el resultado que de un espectrofotómetro que va a medir la variación de Absorbancia de luz de una muestra.

En un ensayo de proteínas de Bradford se emplea un colorante hidrofóbico en una mezcla de agua y de ácido fosfórico. Esta mezcla tiene un color pardo-rojizo y suele comprarse en forma de preparado comercial.

La disolución del colorante al entrar en contacto con el interior de una proteína, vira su color de pardo-rojizo a azul. Este cambio de color se puede medir mediante el uso de un espectrofotómetro cuya fuente de emisión de luz se encuentre a 595nm (espectro visible).

Ensayo de Bradford. De izquierda a derecha con cantidades decrecientes de BSA. Fuente

Este método de medida de cantidad de proteína depende de la interacción entre este colorante hidrofóbico y las proteínas y es muy sensible a la presencia de contaminantes (detergentes, orgánicos…) por lo que hay que tener en cuenta como se ha preparado la extracción de proteínas que vamos a medir. Además tiene un rango lineal bajo, por lo que es necesario realizar disoluciones en muchas ocasiones para que la medida quede dentro del rango de medición.

Para superar estas limitaciones existen varias alternativas también basadas en las medidas mediante espectrofotometría y que suelen adquirirse bien preparadas o bien se fabrican de forma “casera” en el laboratorio siguiendo protocolos establecidos a tal efecto.

La principal ventaja del método de Bradford es que es muy fácil de llevar a cabo y muy rápido (a mi no me lleva más de 10-15 minutos) y cosa que no puedo decir de otros métodos alternativos que se me hacen largos y tediosos.

La segunda de las técnicas es la adquisición de imágenes a través de un escáner láser. Así es, podemos iluminar de forma un gel como los de la anterior entrada o cualquier otro teñido con un fluoróforo (Sypro, ProQ Diamond, etc), punto por punto y a la longitud de onda justa para que sólo ese fluoróforo se excite y nos emita luz y obtener una imagen con una calidad excepcional.

Escáner Typhoon de GEHealthcare

Por ultimo y no menos importante, la aplicación de la luz para iniciar el análisis de la secuencia de péptidos e identificación de proteínas. Para esto también utilizamos láser y en concreto lo hacemos para excitar una serie de moléculas de una sustancia que contiene nuestros péptidos. Es lo que se conoce como fuente de ionización Maldi.

La desorción de iones asistida por láser (MALDI: Matrix-assisted laser desorption ionization) es uno de los dos métodos de ionización “suaves” que actualmente se utilizan en espectrometría de masas. Fue desarrollado por Karas y Hillenkamp a finales de los 80.

Las muestras son coprecipitadas en un soporte metálico con una matriz, es decir, una sustancia usada para inmovilizar la muestra y que permitirá ionizar la muestra. Esta matriz suele ser ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnámico, ácido sinapínico o ácido 2,5-dihidroxibenzoico.

Soporte metálico que se utiliza en una fuente de ionización MALDI. Fuente: Eduardo Chicano

Pues bien, el sólido resultante (recordad, mezcla de matriz y nuestros analitos) depositado sobre ese soporte se irradia con pulsos de láser con longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (normalmente láseres de N2 que emiten a 337 nm).

Para que os hagáis una idea, esto es lo que ocurre:

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI. Fuente

El láser provoca que la matriz se excite y literalmente “salte” del soporte, ionizándose de camino junto con nuestros péptidos, que es lo que nos interesa analizar , entrando en la segunda fase de un espectrómetro de masas, el analizador (tipo TOF, cuadrupolo, etc).

Pero la historia de los componentes y tipos de espectrómetros de masas os lo dejo para otro día…

Este Post participa en la VII edición del Carnaval de Biología, albergado por Manuel Sánchez en su blog Curiosidades de la Microbiología

Del hilo a la madeja

Sigamos con la serie de post básicos…

La estructura de las proteínas viene determinada en primera instancia de su secuencia lineal.
Esta secuencia lineal es la que estuvimos viendo en la entrada anterior (recordad los términos péptido y polipéptido). Esta sería la primera categoría de estructuras de proteínas que vamos a ver. Pero vayamos por orden y no nos adelantemos.
Como os digo podemos clasificar la estructura de las proteínas en 4 categorías:  estructura primaria (lineal), estructura secundaria (hélices alfa y hojas beta), estructura terciaria (disposición tridimensional) y estructura cuaternaria (en proteínas multiméricas).
La estructura secundaria es el resultado de las diferentes interacciones que tienen entre sí los aminoácidos adyacentes en la estructura primaria. Gracias a estas interacciones se forman las hélices alfa y las hojas plegadas beta.
Las hélices alfa nos recuerdan a la típica hélice de ADN que seguro que todos habréis visto en alguna ocasión.

Fuente: http://www2.udec.cl/

En este tipo de estructura, el oxígeno del grupo carbonilo de cada enlace peptídico se une mediante un enlace de hidrógeno al hidrógeno del grupo amino del siguiente aminoácido situado 4 posiciones más adelantadas (en dirección C-terminal). Con esta disposición de los enlaces, la hélice va a presentar polaridad, porque todos los grupos donantes en los enlaces de hidrógeno tienen la misma orientación. La hélice resultante de estos enlaces de hidrógeno tiene 3,6 aminoácidos en cada giro.

Al colocarse estos aminoácidos de forma tan estable, la hélice se comporta como una especie de columna vertebral a partir de las cuales van saliendo todos los grupos R que hemos visto anteriormente.

Fuente: http://biolarioja.com.ar/

Las hojas beta se forman por interacciones “planas” entre dos hileras lineales de aminoácidos o hebras beta.

Las hebras beta están formadas por una cadena polipeptídica corta (5 a 8 aminoácidos) extendida. La unión mediante enlaces de hidrógeno entre los átomos de hebras beta forman las hojas beta. Podéis verlo en la siguiente imagen.

Fuente: http://preujct.cl/

Las hojas beta pueden ser paralelas si el sentido N-terminal y C-terminal son el mismo, o antiparalelas si el sentido es contrario. Mirad el sentido de las flechas de la siguiente imagen. Ahí tenemos hojas paralelas (las dos primeras comenzando desde la derecha arriba) y antiparalelas (las dos siguientes).

Fuente: http://www2.denizyuret.com/

Un claro ejemplo de material que tiene gran cantidad de este tipo de estructura es la seda. Sus fibras están compuestas por este tipo de estructura.No vamos a entrar en más complicaciones como las combinaciones regulares de estructuras secundarias (motivos). No lo creo necesario para el objetivo que me he marcado con este blog, unas líneas para hacer más accesible este mundillo. Aunque si queréis, os lo pongo en otro post.

La estructura terciaria es consecuencia de las interacciones entre las estructuras secundarias. Digamos que la proteína va retorciendose (plegándose) sobre sí misma para adquirir toda su funcionalidad. De esta forma, vamos a tener las hélices alfa y hojas beta dispuestas ya en su posición definitiva en el espacio, lo que permitirá “funcionar” a la proteína. Tampoco aquí os voy a detallar más acerca de otros tipos de combinaciones que se dan en éste nivel, denominadas dominios.

Esta es la estructura “nativa” para la proteína, la que es totalmente funcional:

Fuente: http://swissmodel.expasy.org/

La estructura cuaternaria aparece cuando una proteína funcional esta formada por varias su unidades, bien idénticas o no. Dependiendo del numero de su unidades que van a formar esta estructura proteica podemos indicar si estas su unidades son idénticas o no utilizando los prefijos homo- y -hetero-. Por ejemplo, si son dos las subunidades podemos decir dímero (no indicamos si son iguales o no), homodímero (las subunidades son iguales) o heterodímero (las subunidades son diferentes). Un ejemplo clásico de lo que os estoy contando es la hemoglobina que está en nuestra sangre.

Como resumen, cuando penséis en una estructura de una proteína imaginad que tenéis un ovillo de lana. Como dice el título: Del hilo (estructura primaria) a la madeja (estructura terciaria).

 

Y nada más, por ahora, claro. En el siguiente post ya abandonaremos esta serie de post básicos, que seguro que os está resultando algo pesada ya. Nos adentraremos en algo de historia…

Un saludo!

Lego (o Tente) en las proteínas: el enlace peptídico

Hola de nuevo a todos,

sigamos con la serie de artículos básicos para entender el mundo de las proteínas.

En este segundo post vamos a ver como se unen los aminoácidos entre sí para dar lugar a las complejas secuencias que tienen las proteínas.

Como os digo en el título, el enlace peptídico es el que une entre sí las piezas de este Lego (o Tente para los nostálgicos como yo en España) que es una proteína.

Imaginaos que tenemos dos aminoácidos que van a ser dos de nuestras piezas de Lego. Los enlaces peptídicos serían aquellos que hacen que ambas piezas se queden pegadas entre sí, es decir, vendrían a ser los trozos que sobresalen en una pieza y los huecos de la siguiente. De esta forma iríamos formando una cadena lineal de aminoácidos.

Pero no vamos a simplificar tanto, que sino sería demasiado fácil. Veámoslo desde un punto de vista algo más científico, que para aprender algo de Ciencia estamos por aquí, ¿no?

El enlace peptídico se forma por una reacción de condensación (se libera una molécula de agua) entre el grupo amino (nuestro grupo morado, recordad el anterior post) de un aminoácido y el grupo carboxilo de otro (grupo rojo), de manera que tendríamos una reacción como la que sigue:

Fuente (modificada): Wikipedia

Tras la unión de esos dos aminoácidos, como podeis ver, tenemos un dipéptido. Si se une un tercero, un tripéptido, y así consecutivamente. La cosa iría creciendo así:

Una vez que se forma el enlace, loa átomos repetidos N amido (del grupo morado), Carbono alfa (en verde) y Carbono del grupo carbonilo (del grupo rojo) forman lo que sería la columna vertebral de una proteína. Los grupos R (azul) se van distribuyendo a lo largo de esta “columna vertebral”.

Normalmente a una cadena pequeña de aminoácidos se les llama péptidos y a cadenas más largas polipéptidos. Normalmente, los péptidos suelen tener menos de  20-30 aminoácidos, mientras que los polipéptidos pueden llegar a tener hasta miles de aminoácidos.

Una vez que hemos visto la base, vamos a ver algunas características del enlace peptídico.

En un enlace peptídico no hay giros posibles (hay ángulos de torsión, pero no vamos a entrar en ello) porque tiene un cierto carácter doble enlace y se estabiliza por resonancia. Al ser tan estable este enlace, esto hace que los 4 átomos que forman en enlace más los dos C alfa que se encuentran en posición con respecto a dicho enlace, se encuentren en un plano paralelo al mismo. Esta característica tan peculiar de este tipo de enlace hace que no se pueda llegar a cualquier tipo de conformación en una proteína. Esta conformación viene en parte derivada de este enlace.

Fuente: http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_08.html

Por último, si os fijais un poco, veréis que una cadena peptídica tiene polaridad, es decir, siempre comienza en un extremo con un grupo amino (morado) al que se llama extremo N-terminal y termina con un grupo carboxilo (rojo) que se llama C-terminal.

Aminoácidos, los ladrillos de la vida

Para comenzar, algo ligerito…

Lo primero de todo si vamos a hablar de proteínas y proteómica es saber la base de lo que vamos a hablar  y para ello tenemos que comenzar por el principio.

Este post será el que abra la veda de la categoría de Básicos, es decir, cosas fundamentales para entender el mundo de las proteínas. Para ello comenzaremos con una breve explicación de lo que son sus componentes.

Los aminoácidos como os digo son los ladrillos de la vida, al igual que los nucleótidos (y por ende los ácidos nucleicos ADN-ARN) serían los planos donde viene todo descrito.

Los aminoácidos son los bloques a partir de los cuales construimos las proteínas y se pueden considerar como una especie de alfabeto de 20 letras que viene codificado en esos planos que indican los ácidos nucleicos.

Tienen una estructura esencial formada por un átomo de C central (que se llama C alfa) al cual se unen 4 grupos de átomos diferentes. De estos 4 grupos, 3 se repiten de forma continua: un grupo amino (NH2), un grupo carboxilo (COOH) y un átomo de hidrógeno (H).

El último grupo, el grupo R (o cadena lateral) es el que caracteriza a cada uno de estas 20 letras del alfabeto proteico y es el que le da sus características de tamaño, carga, hidrofobicidad, reactividad, etc.

Para que no nos liemos, vamos a nombrar los grupos anteriores como grupo morado (NH2), grupo rojo (COOH), hidrógeno naranja y grupo azul (cadena lateral)

De esta manera, el conjunto queda así:

Fuente (modificada): Wikipedia (http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:AminoAcidball.svg)

El bloque básico de la estructura esencial de un aminoácido de la que os hablaba quedaría aquí así: a la derecha del todo tenéis el grupo amino  en morado), en el centro el carbono alfa (en verde) y a la derecha el grupo carboxilo en rojo. Sobre el C alfa se encuentra el hidrógeno (en naranja).

El cuarto grupo, el grupo R (en azul), queda bajo el carbono alfa (en esta figura) y es, como os digo el que va a conferir las características propias de cada aminoácido.

En función de nuestro grupo azul (recordad, el grupo R o cadena lateral) podemos organizar los aminoácidos de la siguiente forma:

  • Neutros no polaresapolares o hidrófobos: Glicina (Gly, G), Alanina (Ala, A), Valina (Val, V), Leucina (Leu, L), Isoleucina (Ile, I), Metionina (Met, M), Prolina (Pro, P), Fenilalanina (Phe, F) yTriptófano (Trp, W).
  • Con carga negativa, o ácidos: Ácido aspártico (Asp, D) y Ácido glutámico (Glu, E).
  • Con carga positiva, o básicos: Lisina (Lys, K), Arginina (Arg, R) e Histidina (His, H).
  • Aromáticos: Fenilalanina (Phe, F), Tirosina (Tyr, Y) y Triptófano (Trp, W) (ya incluidos en los grupos neutros polares y neutros no polares).

Hey, hey! Espera, espera! Ya estamos complicando la cosa, neutros polares, polares, ácidos, básicos… abreviaturas de tres letras o de una letra ¿que complicado no?

Pues para nada, para nada. No tengáis miedo. Aunque tenéis los correspondientes enlaces a wiki de cada “palabro”, vamos a verlos.

Vamos a quedarnos con la siguiente idea. Como os vengo diciendo, los aminoácidos se clasifican sobre todo en función de su solubilidad en agua, que a su vez depende de la polaridad de lo que venimos llamando grupo azul (cadenas laterales).

Los aminoácidos con grupos azules polares tienden a colocarse sobre la superficie de las proteínas, al interactuar con el agua hacen que las proteínas sean solubles en disoluciones acuosas. Por el contrario, los aminoácidos con grupos azules no polares rechazan el agua y se suelen situar en el núcleo de las proteínas.

Los aminoácidos con grupos azules ionizados o polares son hidrófilos y son solubles en agua, al igual que aquellos que tienen grupos azules alifáticos (insolubles o ligeramente solubles en agua) son hidrófobos.

En resumen y para no liarnos mucho, dependiendo de las características de nuestro grupo azul, los aminoácidos estarán más o menos expuestos al exterior de la proteína y además, gracias a estas características del grupo azul, darán forma a la misma en una serie de estructuras que os detallaré en otro post dedicado a las distintas estructuras de las proteínas.

Lo del tema de las abreviaturas, es un poco más fácil de explicar. Antiguamente, a los aminoácidos se los solía nombrar con una abreviatura basada en tres letras. Por ejemplo,  la glicina se abreviaba como Gly. Hoy día, se utiliza más la abreviatura de una sola letra, en parte por comodidad pero sobre todo por su utilidad a la hora de analizar los aminoácidos que componen una proteína o fragmento de la misma mediante análisis bioinformático. Así, la glicina vendría a abreviarse como G.

Por último, os dejo el siguiente enlace para que veáis como son las abreviaturas de cada aminoácido y cómo se codifican en “los planos” de ARN.