SRM: La validación de resultados del siglo XXI

Hola de nuevo a todos, después de tanto tiempo, vuelvo a escribir un nuevo post.

Esta vez se lo dedico a una persona a la que admiro en divulgación científica. De hecho este año ha ganado el bitácoras en el apartado ciencia. Se trata de Jose, @scientiaJMLN, al cual, si no seguís tanto en su blog como en twitter ya os digo que estáis tardando. Jose, va por tí maestro!

Al grano, pues… Ya sabéis por el post anterior lo bien que me llevo con el Western Blot.  Puede considerarse que el Western es para mi un archienemigo tipo Spiderman-Duende Verde, Sauron en el Señor de los Anillos, o cualquier super malo que se os ocurra.

Aun a pesar de todos los pesares, esta técnica se sigue utilizando a día de hoy como “estándar” para validación de resultados observados en los experimentos que realizamos los pocos locos que seguimos en España haciendo investigación. Ésta técnica como deberíais saber ya, es de los años 70, una época un poco lejana. Pero se sigue utilizando… y diréis todos ¿por qué? ¿No se ha avanzado nada desde esa fecha? Eso digo yo… y como buenos lectores que sois, os voy a explicar una técnica que puede servir (y de hecho bajo mi punto de vista ya debería ser estándar) para realizar el trabajo del Western más barato, más rápido, más específico y lo mejor de todo, de forma cuantitativa, no semicuantitativa como en el caso de mi archienemigo…

La técnica de la que os voy a hablar hoy es el SRM (Selected Reaction Monitoring). Se trata a grandes rasgos de poner un espectrómetro de masas a buscar y cuantificar una o varias proteínas de forma específica en una muestra donde tenemos varios miles de proteínas diferentes.

¡Ah! ¡Muy bien! Seguro que es súper fácil… diréis. Bueno, fácil no es. Ese es el concepto, lo que hay detrás es algo más complicado y es lo que quiero que a grandes rasgos entendáis para que al próximo que os presente al Western como herramienta de validación le déis en los morros con argumentos.

Empecemos. SRM, Selected Reaction Monitoring. Todos sabéis a estas alturas que las proteínas están compuestas por una secuencia de aminoácidos. Esas secuencias de aminoácidos son únicas para cada una de las proteínas que existen. La secuencia de una proteína puede ser “cortada” o digerida con determinadas enzimas (Leed esto). A partir de una digestión tríptica (esto es, con tripsina), la secuencia de aminoácidos de una proteína va a cortarse entre los aminoácidos Arginina y Lisina. De esta forma vamos a obtener una serie de fragmentos denominados péptidos los cuales, gracias a las características de esta enzima, van a ser digamos “estables” en diferentes muestras. Es decir, la tripsina siempre va a cortar en K-R (excepto si a K o R le sigue una P (prolina)), por lo que los péptidos obtenidos siempre van a ser los mismos aunque tengamos diferentes condiciones experimentales. Una vez que tenemos los péptidos de las proteínas, nos interesa conocer los niveles de expresión (o cantidad) de una o varias en concreto. ¿Cómo lo conseguimos? Pues seleccionando aquellos péptidos característicos de una proteína y cuya secuencia solo sea característica de esa proteína. Ese es el primer paso.

Resumiendo, tenemos una proteína cuya expresión queremos medir. Sabemos su secuencia, y la digerimos con tripsina para obtener péptidos de la misma. El péptido o péptidos con secuencia única y característica de esa proteína es lo que buscamos. Ahora quedaría otro paso más…

Normalmente, en un laboratorio de proteómica, se utiliza LC-MS para SRM (se puede hacer también con un Maldi, pero eso es otra cuestión que no viene al caso). Con LC-MS quiero decir que es una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. 

El principal problema que vamos a encontrarnos si medimos con la premisa anterior una proteína es que cuando hagamos la cromatografía líquida, nuestro péptido de interés, el que caracteriza nuestra proteína, va a co-eluir junto a otros péptidos de secuencia diferente pero con la misma hidrofobicidad (se hace normalmente una fase reversa) y lo notaremos principalmente en su relación masa/carga, que es lo que vemos en el masas. Si esto ocurre, no podremos medir nuestra proteína de manera específica, ya que la señal que vamos a obtener va a estar “falseada” con los otros péptidos que no queremos medir. ¿Como solucionar esto y elegir solamente nuestro péptido y medir nuestra proteína? Pues volviendo a seleccionar otra característica de los péptidos: las transiciones o fragmentos originados con un espectrómetro de masas a partir de nuestro péptido de interés.

En los masas, como el triple cuadrupolo, una de sus “cámaras” puede utilizarse como celda de colisión de manera que el instrumento rompe los péptidos que entran en él en diferentes subfragmentos. No voy a entrar en como lo hace.

La cuestión es que esto lo vamos a utilizar de la siguiente forma: aplicamos un primer filtro en la primera fase de masas en la que seleccionamos la masa/carga (m/z) de nuestro péptido específico y con el cual pueden llegar a entrar algunos péptidos que nos den “ruido”. Después pasamos esos péptidos con esa m/z a la celda de colisión donde los fragmentamos y en una segunda fase de masas (MS2) seleccionamos la m/z de aquellos fragmentos (transiciones) que sabemos que vienen de nuestro péptido de interés y ya medimos de forma muy específica lo que queremos: nuestra proteína.

Todo eso os lo resumo en la siguiente figura (Fuente Kinter et al 2013):

Imagen

Como véis el flujo es sencillo: tenemos 3 péptidos entrando en el masas. El péptido A (el que nos interesa) tiene una m/z (masa/carga) de 370, por lo que ponemos el espectrómetro a seleccionar esa masa en la primera fase (MS1) de forma que solo nos dejará pasar a la siguiente fase los péptidos que tienen esa m/z. Con esto ya nos quitamos el péptido C, pero sin embargo, tenemos al péptido B que nos daría “ruido” en la medición de nuestra proteína.

Para ello pasamos todos los péptidos de m/z 370 a la celda de colisión y de todos los fragmentos generados solamente seleccionamos en una segunda fase (MS2) aquellos que provengan de nuestro péptido de interés (en azul) y más señal nos den y descartamos el resto. Así nos quitamos de enmedio el ruido provocado por el péptido B y sus fragmentos y fragmentos de nuestro péptido de interés que no nos sean útiles.

Todo este proceso se diseña en laboratorio bajo supervisión y no es tan sencillo como os lo explico aquí ya que hay que tener en cuenta multitud de factores, pero bueno, por lo menos así ya tenéis un arma más para matar a mi archienemigo.

¿Ventajas? Pues muchísimas: especificidad, cuantificación absoluta (no relativa como el Western), no se depende de una reacción de un anticuerpo, podemos medir hasta 100 proteínas (cuantificarlas, vamos) en un solo pase… etc, etc. Por no hablar de dinero, una cosa muy importante en tiempos de crisis. Creo que así a ojímetro, tras poner a punto el método puedes reducir los costes a una quinta parte de lo que cuesta un Western en igualdad de condiciones y además puedes hacer las mediciones más rápido, en cuestión de minutos.

Y lo mejor: una vez que diseñas el método de SRM te va a servir para toda la vida. Siempre es lo mismo. Y ya hay bases de datos en constante crecimiento donde los locos como yo vamos depositando esos métodos para que la comunidad científica los tenga a mano.

Espero que os haya entretenido aunque sea un rato ;-P

 

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Acerca de Eduardo Chicano

www.proteomeplus.wordpress.com

Publicado el 16 febrero, 2014 en Sin categoría y etiquetado en . Guarda el enlace permanente. 2 comentarios.

  1. Interesante, no sabía que se podía hacer eso. Yo soy de los que siguen haciendo western, pero como los hago muy de vez en cuando, me llevo bien con el jajaja.

    Respecto al coste, una cosa, hay que tener en cuenta en el coste que un maldi no es barato, ni todo el mundo sabe manejarlo de rutina, con lo que se necesita personal especializado. Un cromatógrafo es algo más llevadero, pero igualmente necesitas espacio (que por desgracia cada vez nos sobra mas) y material. Con lo que, si ya tienes el instrumental, si, hacer cada prueba es mas barato, pero primero tienes que tenerlo o disponer de un servicio en tu centro.

    Gracias, interesante entrada.

    • Me alegra que te haya gustado Oskar. Es cierto, lo del coste lo he referido a coste de un servicio centralizado como el que llevo en @imibic. Un grupo de investigación por su cuenta no puede mantener un equipo de estos por sí solo. Pero dime una cosa, ¿no estarías dispuesto a pagar 100 euros por ejemplo para que te cuantifiquen en un servicio tu proteína o proteínas de interés? Y de forma cuantitativa…
      Un saludo y gracias por tu comentario!

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