Digestiones e ionizaciones en el laboratorio

Antes de empezar con la serie de artículos interesantes creo que es necesario que sepáis algunos conceptos básicos que ocurren en el laboratorio antes de pasar a utilizar el espectrómetro de masas, como son la digestión y un par de tipos básicos de ionización.

Digestión

¿En que consiste exactamente una digestión cuando estamos en proteómica? Como sabéis las proteínas están hechas de una serie de piezas tal y como os puse en un post anterior. Cuando lo que queremos es identificarlas y saber la secuencia exacta en la que los aminoácidos están presentes en esa proteína utilizamos un espectrómetro de masas o secuenciación de Edman.

Actualmente, en proteómica tanto basada en geles como en líquido, se suele “cortar” esas proteínas en trozos más pequeños denominados péptidos para que el espectrómetro de masas que estemos utilizando sea capaz de darnos la secuencia de los mismos. De esta forma podemos saber rápidamente la secuencia o deducirla y podemos llegar a identificar la proteína o las proteínas en cuestión de minutos. Para ello comparamos las secuencias obtenidas con las bases de datos públicas disponibles en la red, siendo Uniprot una de las más utilizadas (bajo mi punto de vista, la mejor).

Tripsina (Fuente: RCSB)

Tripsina (Fuente: RCSB)

Vale, todo esto está muy bien… ¿pero como se hace una digestión? En proteómica utilizamos una especie de “tijeras moleculares”, unas enzimas (de la familia de las proteasas) las cuales están perfectamente caracterizadas tras años de estudio y de las cuales sabemos perfectamente su comportamiento.

La reina indiscutible para estos menesteres en proteómica es la tripsina. Esta enzima (que no encima, eso es arriba), rompe los enlaces peptídicos mediante una reacción de hidrólisis y se forman péptidos y aminoácidos a partir de una proteína completa. Normalmente la tripsina se produce de forma general en muchas células incluyendo entre sus localizaciones el cristalino, leucocitos, eritrocitos, piel, parótida, riñón e hipófisis, aunque es producida mayoritariamente en el páncreas y secretada en el digestivo a nivel del duodeno donde es esencial para la digestión que todos hacemos todos los días.

Esta proteína se puede purificar a partir de extractos de páncreas de cerdo y se compra comercialmente en casas especializadas en este tipo de productos (no, no voy a hacer publicidad gratuita, el que quiera saber alguna referencia que me pregunte, no hay problema 😉 ).

Bien, ya hemos hecho trizas nuestra proteína y la tenemos cortadita y picadita como si fuese un puerro, en juliana… Ahora toca prepararla para su análisis mediante espectrometría de masas.

Hago un pequeño paréntesis: normalmente la preparación de la muestra tanto antes de la digestión como después de la misma es un paso crítico para la obtención de unos resultados como Dios manda. Os lo recuerdo por si acaso no lo sabíais. Es más, una mala preparación pre-digestión o post-digestión os puede condenar al desastre en vuestro experimento si no lo habéis hecho con el máximo cuidado y esmero. Como responsable de un servicio de proteómica os digo que llega cada cosa a los servicios que os pondría los pelos de punta. Por favor, cuidad vuestras muestras. Intentad ser lo más cuidadosos posible y entregad las mismas a los servicios de proteómica en unas condiciones óptimas. De vuestro trabajo dependen en la mayoría de las ocasiones unos buenos resultados.

Columna de fase reversa C18. Observad la punta de la pipeta: esa cosita blanca que hay ahí es la resina donde se inmobilizan los péptidos

Columna de fase reversa C18. Observad la punta de la pipeta: esa cosita blanca que hay ahí es la resina donde se inmobilizan los péptidos

En fin, como os decía, tras la digestión, estas muestras suelen limpiarse tanto de restos de gel en su caso como de sales mediante la utilización de columnas de fase reversa,normalmente inmovilizadas en la punta de una micropipeta. Una columna no es más que una resina sintética que se coloca sobre esa punta de pipeta como si fuese una especie de filtro. La muestra (ya convertida en péptidos y aminoácidos) se pasa a través de esa columna, se retiene allí (interacciona con la resina) y se le pasan varias veces una serie de tampones para limpiar las sales y finalmente, se suelen eluir en un tampón compatible con nuestra fuente de ionización, dependiendo del espectrómetro de masas a utilizar, etc.

Fuentes de Ionización

En Proteómica se suelen utilizar principalmente fuentes de ionización bastante suaves. Yo os voy a hablar de la fuente de ionización tipo MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) que en cristiano viene a ser algo así como desorción/ionización láser asistida mediante matriz, y de la ionización tipo ESI (Electrospray Ionization).

Normalmente la fuente tipo MALDI se utiliza off-line, es decir, el espectrómetro que la utiliza no tiene ningún equipo asociado que permita el análisis continuado de muestra, como sí ocurre con la fuente tipo ESI, que es más común en espectrómetros de masas que tienen en cabecera on-line un nanoHPLC normalmente, lo que permite un análisis contínuo de muestra.

Placa MALDI donde se cocristalizan las muestras y la matriz

Placa MALDI donde se cocristalizan las muestras y la matriz

Mi especialidad es el MALDI, como os ireis dando cuenta con el tiempo. Este tipo de ionización se suele montar en un espectrómetro de masas que tiene como analizador un TOF o un TOF/TOF. No, no estoy tosiendo, jejejejeje. TOF significa Time Of Flight y lo que hace este tipo de analizador es separar las muestras que le entran mediante su relación masa/carga respecto al tiempo que tardan en recorrerlo. Pero bueno, ahora mismo esto no viene al caso, centrémonos en las fuentes de ionización.

La fuente MALDI consiste básicamente en lo siguiente: las muestras son coprecipitadas con una matriz, es decir, una sustancia usada para inmovilizar la muestra en un soporte metálico y que permitirá ionizar la muestra. El sólido resultante sobre el soporte se irradia con pulsos de láser con longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (normalmente láseres de N2 que emiten a 337 nm).

La matriz que se suele usar es casi siempre una molécula orgánica pequeña cuya absorbancia se encuentra dentro de la longitud de onda del láser que se esté usando. Las matrices difieren en la cantidad de energía que donan a las biomoléculas durante el proceso de desorción e ionización. El trabajo con biomoléculas casi siempre se realiza usando como matrices bien ácido α-ciano-4-hidroxicinnámico (CHCA) o bien ácido dihidrobenzoico (DHB).

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI (Fuente: www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI (Fuente: http://www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización ESI (Fuente:www.magnet.fsu.edu)

Funcionamiento de una fuente de ionización ESI (Fuente: http://www.magnet.fsu.edu)

Con respecto a la fuente de ionización tipo ESI os diré que este método de ionización usa una aguja a cuyo través se bombean flujos muy reducidos de una disolución (nanolitros de una mezcla entre orgánico y agua, como metanol:agua, 50:50) con el analito disuelto. En su punta se aplica un voltaje muy alto por lo que el fluido se dispersa electrostáticamente en pequeñas gotas que se evaporan y dan su carga a las moléculas de analito que se ionizan a presión atmosférica. Para estabilizar el spray producido se suele usar un gas inerte. Una vez ionizado y estabilizado el spray, las moléculas de analito se transfieren al espectrómetro de masas con muy alta eficiencia.

Una vez ionizadas las moléculas de nuestra muestra, estas entran en los analizadores de los espectrómetros de masas que estemos utilizando, pero eso amigos míos, es otra historia que os contaré en otra ocasión.

Esta entrada participa en el XX Carnaval de Química organizado por @bioamara en su blog La ciencia de Amara.

Anuncios

Acerca de Eduardo Chicano

www.proteomeplus.wordpress.com

Publicado el 28 diciembre, 2012 en Básico. Añade a favoritos el enlace permanente. 7 comentarios.

  1. Veo que la ausencia temporal no ha hecho mella en la calidad y claridad de tus post.
    Felicidades crack. Perfectamente explicada!
    Espero la siguiente parte :-))

  2. Buscando información sobre proteómica (área en la que voy a trabajar en mi posgrado) llegué hasta acá. Como todavía es un tema algo nuevo para mí encontrar este blog me fue de muchísima ayuda. Sos un genio explicando y me facilitaste entender muchas cosas que las tenía en el aire. No dejes de escribir. 🙂

  3. Muy buen artículo. Muy bien explicado. Espero que tengas suerte en tu posgrado. Yo pasé por uno y buff.. el Trabajo Fin de Máster me llevó mucho tiempo y trabajo.

    Un abrazo.

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s

A %d blogueros les gusta esto: