Una de Western

Excusas para explicar mi prolongada ausencia del blog tengo un montón, pero para que engañarnos, os he dejado de la mano de Dios y no hay perdón posible.

Entre trabajo (muchísimo), familia y las fechas que acaban de pasar, pues nada, el blog es el que pierde… Pero bueno, ya estamos aquí de nuevo con fuerzas renovadas y esperando que este año sea muchísimo mejor que el que ha pasado. A ver si es verdad.

Vamos al tema. El Western… mmmmm….. esa técnica que he aprendido a amar tanto como a odiar. A amarla porque cuando sale el experimento y lo tienes bien puesto a punto es una auténtica delicia, pero mientras la pones a punto o no, la odias a muerte cada vez que ves que el tiempo pasa y que los resultados no llegan. Os explico a mi manera (a nuestra manera) en lo que consiste esta técnica.

 

Imaginad por un momento que hacéis un experimento clásico de proteómica. Hacéis vuestro gel bidimensional, analizáis las imágenes, recortáis las manchas de interés de los geles e identificáis mediante espectrometría de masas la proteína que os está dando diferencia de expresión en vuestros análisis. Hasta ahí, todo correcto.

El siguiente paso sería la validación de los resultados y aquí es donde entra en juego nuestro amigo: El Western Blot.

El Western Blot (WB) es una técnica que nos sirve para detectar una proteína de interés de entre un conjunto complejo de las mismas. Para esa detección se utilizan anticuerpos específicos para esa proteína y después mediante el acoplamiento de distintos reactivos se puede llevar a cabo la visualización de esta proteína en esa mezcla.

Lo primero de todo para hacer un WB es separar la mezcla compleja de proteínas de partida con una electroforesis unidimensional. En este tipo de electroforesis separamos las proteínas únicamente por su tamaño. Las proteínas aparecerán a lo largo del gel de electroforesis formando bandas según su tamaño molecular.

Electroforesis unidimensional. (Fuente: Wikipedia)

A continuación se realiza una transferencia de estas proteínas separadas por tamaño a una membrana de nitrocelulosa o PVDF (Polifluoruro de vinilideno) donde quedarán inmovilizadas y donde se realizarán los tratamientos de detección. La membrana une proteínas de forma inespecífica lo cual podría representar un problema a la hora de realizar esa detección.

Montaje para llevar a cabo la transferencia a la membrana (Fuente: cultek.com)

Por ello, una vez que hemos realizado la transferencia se hace el bloqueo de la membrana. Imaginad que la membrana es como un papel en blanco donde hemos dibujado una serie de bandas, pero queremos rellenar todo este papel en blanco con color para que no nos quede ningún sitio libre donde se pueda dibujar. Eso es lo que hacemos con el bloqueo. El bloqueo se lleva a cabo utilizando leche desnatada, así, las proteínas de la leche nos rellenarán los huecos que han quedado sin proteína en la membrana para que nada más se una a ella.

Ya hemos realizado una electroforesis, una transferencia y hemos bloqueado la membrana. Ahora lo que tenemos que hacer es la hibridación con el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario es un anticuerpo específico producido para reaccionar con nuestra proteína de interés. Este anticuerpo suele producirse en modelos animales (ratón, conejo, cabra, cultivos celulares…) y se purifica. Pero tranquilos, que no hace falta que purifiquemos nada. Actualmente hay muchas casas comerciales (no pienso hacer publicidad) que se dedican a “fabricar” anticuerpos contra todo tipo de proteínas que os podáis llegar a imaginar. Para producir estos anticuerpos lo que hacen es inocular a estos modelos animales la proteína completa o una parte de ella para que su cuerpo produzca anticuerpos contra esa proteína. Una vez que consiguen esto es cuando purifican ese anticuerpo y nos lo venden a precio de oro. Así a bote pronto, os puedo decir que el anticuerpo con el que estoy trabajando ahora cuesta unos 350 €/50ul. Sí, sí, 50 microlitros…

Sigamos… La hibridación con este anticuerpo primario nos permite,  poner una “etiqueta” a nuestra proteína de interés y aquí es donde entra en juego la hibridación con el anticuerpo secundario.

Lo sé, lo sé, anticuerpo primario, anticuerpo secundario… ¡Vaya lío! Nada de eso. Ahora lo vemos.

Pensad por un momento que estamos utilizando un conjunto de proteínas de ratón, que hemos separado, transferido y bloqueado. Nuestra proteína de interés,  vamos a poner por ejemplo, es la GAPDH (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). Entonces tendremos que buscar un anticuerpo primario anti-GAPDH de ratón. Ese anticuerpo puede proceder bien de modelos de ratón, de conejo, etc., pero para no complicar más la cosa vamos a poner que ese anticuerpo anti-GAPDH está “fabricado” en ratón. Hibridamos con nuestro anticuerpo primario.

Ahora que tenemos “la etiqueta” pegada a la GAPDH que tenemos en esas bandas de la membrana tenemos que buscarnos una forma de poder verla. Para eso se utiliza el anticuerpo secundario. Estos anticuerpos suelen estar modificados de forma que nos permitan utilizar métodos de detección enzimática (botina, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina), radiactiva, fluorescente , etc.

Recordad que estamos trabajando con un anticuerpo primario de ratón, por lo que necesitaríamos un anticuerpo general anti-ratón que se una a nuestro anticuerpo primario de forma específica. En eso consiste la hibridación con el anticuerpo secundario, en pegarle multitud de anticuerpos modificados para la detección al anticuerpo primario y por ende para la detección de nuestra proteína.

Detección quimioluminiscente con peroxidasa de rábano (Fuente: Wikipedia)

Por último ya es cuestión de utilizar el método de revelado del WB que hayamos escogido con nuestro anticuerpo primario. En mi caso utilizo para la detección película fotográfica y luminol/peróxido (detección con peroxidasa de rábano) para poder ver esa proteína que estoy buscando.

Para una descripción más detallada de toda la técnica os recomiendo visitar la entrada del WB de la Wikipedia. Creo que lo resumen muy bien, pero seguro que no tan ameno como os lo he explicado yo.

Si tenéis alguna duda o pregunta que hacerme ya sabéis que estoy disponible a través de los comentarios en el blog o en mi twitter @educhicano.

Pues nada más, espero que os haya gustado esta entrada. Un saludo!

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Acerca de Eduardo Chicano

www.proteomeplus.wordpress.com

Publicado el 20 enero, 2012 en Técnicas. Añade a favoritos el enlace permanente. 15 comentarios.

  1. Perfectamente explicado Edu. No te niego que es una técnica que yo odio más que amo, posiblemente porque la tengo abandonadilla (genómica) y cuando me toca, la cojo con “miedo”.
    Fantástica entrada!

    Amara

    • Tampoco te creas que yo le tengo un aprecio superior… pero bueno, como digo, es genial si la tienes ya puesta a punto.
      Me alegro de que te haga gustado. Hoy es que estaba inspirado 😉

  2. Muy buena tu explicación del Western. Creo que los que utilizamos esta técnica tenemos esa relación amor-odio que nombras. En mi caso sobre todo cuando empezaron a enseñarme. Le tenía mucho miedo porque eran muchos pasos donde podía cagarla. Pero ahora cuando salen los resultados es genial.

    Sigue escribiendo post tan buenos como este!

    =)

  3. Gracias !!!!! 😉

  4. jajaja si es verdad, yo la odie, ame y ahora la odio de vuelta, sé que la llegaré a amar de nuevo

  5. Por el momento lo odio …estoy simplemente estandarizandolo pero me da muchos lios, primero con la electroforesis, algo tan simple pero eso ya esta superado, ahora aunque use la misma técnica y el mismo proceso aveces me sale la transferencia y aveces no, estoy transfiriendo a membrana de PVDF, pero ya no se que mas modificar, si me puedes ayudar con algunos tips te lo agradezco: vinol11@hotmail.com

    • Hola vivi,
      gracias por el comentario. Pues lo primero es que salga la electroforesis. Eso por lo que veo ya está.
      ¿Cómo haces la transferencia? Yo normalmente lo que hacía era la transferencia en 60 min a 90V y a 4ºC. Después para ver si has transferido puedes teñir la membrana mediante un Ponceau, que es facil.

      • Despues de leer todos los comentarios, te pregunto justo en este que es el que más que interesa debido a la pregunta que te voy a hacer…

        Si tiñes la membrana con Ponceau, después puedes seguir con el proceso de el bloqueo anticuerpo primario y secundario? o puedes bloquear la membrana , teñirla con el Ponceau y seguir hibridandola con el anticuerpo primario? o una vez tiñes la membrana ya no es útil?

        El post es de hace 4 años pero espero que tengas respuesta, gracias Eduardo!

      • Hola Ian,
        el objetivo de teñir con Ponceau es ver que has realizado la transferencia correctamente para poder continuar con la hibridación del primario, etc. Si con el Ponceau no ves bandas en la membrana eso significará que tu transferencia no se ha realizado y tienes que repetirla de nuevo. Así te puedes ahorrar el dinero que te costaría gastar el primario que suele ser caro.
        Se que el post es antiguo pero como ves sigo por aquí para las preguntas que tenéis
        Un saludo

  6. Muy buena explicacion amigo……tengo una duda, en realidad no sé si ya la explicaste pero igual te la hago presente para que puedas despejarmela del todo: que diferencia existe entre una prueba de WB específica y una inespecífica????…gracias de antemano x la respuesta

  7. ¿Qué reactivo debo usar si quiero determinar el peso molecular de una proteina mediante una tecnica electroforetica?
    Por favor contestenme.
    Gracias.

    • Hola Ana. Gracias por tu comentario.
      Normalmente, cuando se lleva a cabo una electroforesis solemos dejar hueco en uno de los pocillos del gel para cargar una disolución de proteínas de masas conocidas. Las llamamos patrones de peso molecular.
      Una vez has hecho la electroforesis puedes deducir (de forma aproximada) la masa molecular de la proteína que te interesa mediante un cálculo sencillo que consiste en comparar la altura a la que se ha quedado tu proteína con respecto a la calle de los patrones de peso molecular. Si calculas las distancias que han recorrido los patrones podrás tener una recta de progresión tipo logarítmica de manera que dependiendo de la altura o tramo que te comentaba antes que ha recorrido tu proteína puedes inferir directamente la masa aproximada de tu proteína de interés.

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