Nosotros también tenemos colores

Mis colegas que trabajan en Biología Celular tienen unas de las aplicaciones de proteínas más chulas y que más me han fascinado desde que entré en este inmenso mundo que es la Ciencia. Os confieso que la primera vez que pude ver una cosa así en directo en un microscopio confocal me quedé literalmente sin palabras y entendí la de vueltas que llegamos a darle a las cosas los científicos con tal de realizar experimentos útiles.

Gato con el gen de GFP insertado. Fuente: Xatakaciencia

Efectivamente, os hablo de las proteínas fluorescentes. Ellos utilizan generalmente tres tipos de proteínas (GFP, YFP y RFP) para poder ver “in vivo” los acontecimientos que están ocurriendo en la célula y que son de su interés. Recientemente habéis podido ver su utilidad para poder observar el desarrollo de una enfermedad similar al SIDA en gatos tal y como podéis ver arriba.

Pero espera… ¿que es GFP, YFP, RFP? Son los acrónimos de Green Fluorescent Protein (GFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP) y Red Fluorescent Protein (RFP).

La GFP es una proteína que produce de forma natural la medusa Aequorea victoria. Esta proteína está constituida por 238 aminoácidos, los cuales forman once cadenas beta consecutivas que forman un cilindro en cuyo centro se encuentra una hélice alfa (espero que a estas alturas ya os hayáis leído la entrada de estructura del blog).

Estructura de la GFP. Fuente: Wikipedia

Esta proteína emite luz en la zona verde del espectro visible, por eso la vemos de color verde cuando iluminamos la célula/tejido/organismo con luz ultravioleta.

Esta proteína bioluminiscente se ha convertido en una herramienta clave en muchos de los experimentos de Biología Molecular y Celular desde hace varios años y nos ha permitido observar la expresión de genes y otras moléculas dentro de células u organismos completos. Las aplicaciones de la GFP son innumerables.

Como siempre, detrás de un gran descubrimiento suele haber grandes científicos que lo han llevado a cabo. De hecho, el descubrimiento, caracterización y aplicación de la GFP fueron el motivo por el que los estadounidenses Martin Chalfie y Roger Tsien y el japonés Osamu Shimomura compartieran el Premio Nobel de Química en 2008.

Osamu Shimomura fue la primera persona en aislar la GFP a partir de la Aequorea victoria e identificar qué parte era responsable de la fluorescencia. Martin Chalfie supo cómo utilizar la GFP para visualizar procesos en Biología Celular y por último, Roger Tsien, diseñó nuevas variantes de la GFP que brillan en distintos colores (YFP, RFP). Si queréis más información sobre aplicaciones que utilizan este tipo de proteínas no os olvidéis de visitar esta entrada del blog Jindetrés sal! del genial @DrLitos.

Utilización de diferentes proteínas fluorescentes en el marcaje de distintos compartimentos celulares. Fuente: Nikon

Es más,  si lo que realmente queréis es la máxima información en profundidad acerca de la cantidad de variantes que existen y las propiedades de estas proteínas tan especiales os recomiendo este enlace (en inglés).

Pero no solo los chicos pijos de Biología Celular tienen colores para “jugar”… En clase, también los tenemos los proteómicos, aunque utilizando una aproximación un poco diferente.

En este caso os voy a explicar como conseguimos nosotros los colores con los que jugar. En definitiva se trata de añadirle a cada una de las muestras que estemos analizando el color que queremos.

Los proteómicos utilizamos para “teñir” las muestras (las proteínas) unos grupos químicos denominados cianinas que podemos unir a las lisinas que tienen las proteínas que estamos analizando.

La técnica con la que conseguimos los colores tiene como nombre DIGE (Differential In Gel Electrophoresis) y corrige los problemas de reproducibilidad, detección de manchas y posterior análisis de la 2-DE convencional. Se basa en las propiedades de 3 tipos de fluoróforos de la familia de las cianinas (CyDye: Cy3, Cy2, Cy5), que emiten luz a distinta longitud de onda.

Normalmente, los reactivos comerciales que se utilizan tienen un grupo reactivo (éster NHS) y están diseñados para formar un enlace covalente con el grupo amino (epsilon) de los aminoácidos de lisina de las proteínas vía unión amida. El fluoróforo añadido a la proteína de esta forma no nos va a varíar el pH de la proteína pero incrementa el tamaño de la misma sólo un poco y por eso se tiene en cuenta a la hora de analizar.

Bien, como os digo, cada muestra se marca con uno de los fluoróforos y, tras el marcaje, se mezclan antes del isoelectroenfoque. De esta forma se separan hasta 3 muestras diferentes (2 problema y 1 control generado al mezclar ambas, ó control interno) en un sólo gel, eliminándose la variación entre geles y asegurando que los efectos de sobre/sub-expresión visualizados en el gel se deben sólo a cambios biológicos. Así, cada mancha de proteína puede ser comparada fácilmente en distintas condiciones de manera semicuantitativa.

Esquema de un experimento DIGE clásico (Fuente: GEHealthcare)

Después de haber realizado la segunda dimensión de la electroforesis los geles con las 3 muestras se digitalizan mediante el uso de un escáner láser que excita a cada cianina en su longitud de onda correspondiente. Así obtenemos de cada gel 3 imágenes como estas:

Imagenes de un experimento DIGE obtenidas con un escáner láser. Fuente: Ludesi

Y una vez que se han obtenido nuestras muestras coloreadas podemos analizarlo mediante un software específico para ello y así poder comprobar que proteínas varían su expresión dependiendo de cada una de las muestras. Es tras el análisis cuando las escindiremos del gel y las analizaremos mediante espectrometría de masas.

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Acerca de Eduardo Chicano

www.proteomeplus.wordpress.com

Publicado el 2 noviembre, 2011 en Sin categoría. Añade a favoritos el enlace permanente. 9 comentarios.

  1. Qué interesante Edu!!
    Me pilla de refilón lo que cuentas. Yo conozco el GFP porque lo hemos usado alguna vez. Tengo alguna foto espectacular para enseñarte pero no he encontrado tu mail. En cuanto al DIGE, en su momento me informé, busqué bibliografía, intenté aprender por todos los medios porque era la primera persona que lo iba a hacer en el instituto pero al final no me dio tiempo de hacerlo (o me acojoné). Qué pena que por aquel entonces no te conociera para darme ese empujón que necesitaba y preguntarte cuatro cosas!!
    Como proteómico, imagino que también harás western. Qué usas para teñir en este caso?

    Buen post compañero!!!
    Un abrazo.

  2. Ohhhh!!!! Mandame la imagen que la cuelgue aquí!!! Pero ya!
    Por lo del DIGE yo también estaba acojonado la primera vez que lo hice, también era el primero en hacerlo en mi departamento, pero ya lo hacemos de forma rutinaria. De hecho, es @rfcisnal el que se encarga ahora de hacerlo. Yo me dedico más a marcaje con iTRAQ y shotgun proteomics sin pasar por geles.
    También hacemos westerns pero más que nada para validar los resultados que nos vamos encontrando con la espectrometría de masas. Para teñir, lo que hacemos es revelar las membranas con ECL-Plus (creo que se llamaba así) de GEHealthcare (un kit comercial) y con los típicos “potingues” de fotografía y películas para rayos de Kodak.

  3. muy interesante el post edu!! pero tenias que haberle dicho a ricardo que te hiciese los comentarios pa tontos…..que yo ya lo de los colores de las manchitas me lo sabia como “ponerle camisetas a cada una de un equipo pa ver luego como hacian las carreras” jajaja. aun así reitero que está genial.

  4. Exacto. Me he dado cuenta que por aquí usaban la solución de Ponceau para teñir la membrana pero luego, efectivamente usan el ECL Plus Western Blotting.
    Es que me suena el nitrato de plata, pero ahora no caigo para qué…

    Como ves, yo soy más genómica :S ainsss

  5. Bueno.. “me he dado cuenta” no. He cogido el protocolo para recordarlo porque hace 1000 años que lo hice :-/

    • No te creas, que yo también he preguntado para asegurarme de que te daba la información correcta. Es que por aquí tampoco es que lo hagamos todos los días (bueno, cuando toca es un infierno).
      El Ponceau también lo utilizamos para comprobar que ha habido transferencia a la membrana. Y lo del nitrato… ni idea, pero lo investigaré XD

  6. Bueno bueno bueno…Yo que pensaba dejar una puya y me he encontado un post que me ha encantado…como bioquímico y amante de los procesos bioluminiscentes solamente me queda felicitarte y decirte que en mi Blogroll ya hay un hueco para este pedazo de Blog que me voy a encargar personalmente que sea más conocido que un tal….¿Varas?

    PD: Los Bioquímicos también somos pijos….

    Un abrazo maestro!!

    • Gracias maestro! Eso significa que tengo el aprobado? 😉
      Ah, me alegra que te guste el avatar que he puesto. El de la foto de Varas me lo guardo para el partido de vuelta en el Pizjuán!
      Un gran abrazo

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