Archivos Mensuales: noviembre 2011

Hágase la luz

La luz… Una dualidad onda/corpúsculo que lleva con nosotros desde el comienzo de los tiempos… Y que también sirve, como no, para realizar análisis en Proteómica.
Así a bote pronto se me ha ocurrido explicaros 3 aplicaciones cotidianas en todo laboratorio de Proteomica que se precie que usan la luz como método de análisis o como parte de un análisis.

Luz láser. Fuente

La primera de estas técnicas es una de las mas citadas por todos los artículos proteómicos: la técnica de Bradford.

Esta técnica sirve para medir la cantidad de proteína presente en una muestra. Sí, lo se, lo se, hay mas métodos (por ejemplo, el método de Lowry)  pero al fin y al cabo todos basan su medida final en el resultado que de un espectrofotómetro que va a medir la variación de Absorbancia de luz de una muestra.

En un ensayo de proteínas de Bradford se emplea un colorante hidrofóbico en una mezcla de agua y de ácido fosfórico. Esta mezcla tiene un color pardo-rojizo y suele comprarse en forma de preparado comercial.

La disolución del colorante al entrar en contacto con el interior de una proteína, vira su color de pardo-rojizo a azul. Este cambio de color se puede medir mediante el uso de un espectrofotómetro cuya fuente de emisión de luz se encuentre a 595nm (espectro visible).

Ensayo de Bradford. De izquierda a derecha con cantidades decrecientes de BSA. Fuente

Este método de medida de cantidad de proteína depende de la interacción entre este colorante hidrofóbico y las proteínas y es muy sensible a la presencia de contaminantes (detergentes, orgánicos…) por lo que hay que tener en cuenta como se ha preparado la extracción de proteínas que vamos a medir. Además tiene un rango lineal bajo, por lo que es necesario realizar disoluciones en muchas ocasiones para que la medida quede dentro del rango de medición.

Para superar estas limitaciones existen varias alternativas también basadas en las medidas mediante espectrofotometría y que suelen adquirirse bien preparadas o bien se fabrican de forma “casera” en el laboratorio siguiendo protocolos establecidos a tal efecto.

La principal ventaja del método de Bradford es que es muy fácil de llevar a cabo y muy rápido (a mi no me lleva más de 10-15 minutos) y cosa que no puedo decir de otros métodos alternativos que se me hacen largos y tediosos.

La segunda de las técnicas es la adquisición de imágenes a través de un escáner láser. Así es, podemos iluminar de forma un gel como los de la anterior entrada o cualquier otro teñido con un fluoróforo (Sypro, ProQ Diamond, etc), punto por punto y a la longitud de onda justa para que sólo ese fluoróforo se excite y nos emita luz y obtener una imagen con una calidad excepcional.

Escáner Typhoon de GEHealthcare

Por ultimo y no menos importante, la aplicación de la luz para iniciar el análisis de la secuencia de péptidos e identificación de proteínas. Para esto también utilizamos láser y en concreto lo hacemos para excitar una serie de moléculas de una sustancia que contiene nuestros péptidos. Es lo que se conoce como fuente de ionización Maldi.

La desorción de iones asistida por láser (MALDI: Matrix-assisted laser desorption ionization) es uno de los dos métodos de ionización “suaves” que actualmente se utilizan en espectrometría de masas. Fue desarrollado por Karas y Hillenkamp a finales de los 80.

Las muestras son coprecipitadas en un soporte metálico con una matriz, es decir, una sustancia usada para inmovilizar la muestra y que permitirá ionizar la muestra. Esta matriz suele ser ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnámico, ácido sinapínico o ácido 2,5-dihidroxibenzoico.

Soporte metálico que se utiliza en una fuente de ionización MALDI. Fuente: Eduardo Chicano

Pues bien, el sólido resultante (recordad, mezcla de matriz y nuestros analitos) depositado sobre ese soporte se irradia con pulsos de láser con longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (normalmente láseres de N2 que emiten a 337 nm).

Para que os hagáis una idea, esto es lo que ocurre:

Funcionamiento de una fuente de ionización MALDI. Fuente

El láser provoca que la matriz se excite y literalmente “salte” del soporte, ionizándose de camino junto con nuestros péptidos, que es lo que nos interesa analizar , entrando en la segunda fase de un espectrómetro de masas, el analizador (tipo TOF, cuadrupolo, etc).

Pero la historia de los componentes y tipos de espectrómetros de masas os lo dejo para otro día…

Este Post participa en la VII edición del Carnaval de Biología, albergado por Manuel Sánchez en su blog Curiosidades de la Microbiología

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PROTEÓMICA CLÍNICA: ASPECTOS BÁSICOS Y APLICACIONES

Os informo que próximamente se va a celebrar  la 1ª Edición del curso “PROTEÓMICA CLÍNICA: ASPECTOS BÁSICOS Y APLICACIONES” que se impartirá entre los días 15 y 17 de Noviembre.
La información completa del curso, así como las fechas de preinscripción y matrícula, las tenéis disponibles en la web del Servicio de Formación Permanente de la Universidad de Córdoba o en la web del SCAI (Servicio de Apoyo a la Investigación) de la Universidad de Córdoba.

Nosotros también tenemos colores

Mis colegas que trabajan en Biología Celular tienen unas de las aplicaciones de proteínas más chulas y que más me han fascinado desde que entré en este inmenso mundo que es la Ciencia. Os confieso que la primera vez que pude ver una cosa así en directo en un microscopio confocal me quedé literalmente sin palabras y entendí la de vueltas que llegamos a darle a las cosas los científicos con tal de realizar experimentos útiles.

Gato con el gen de GFP insertado. Fuente: Xatakaciencia

Efectivamente, os hablo de las proteínas fluorescentes. Ellos utilizan generalmente tres tipos de proteínas (GFP, YFP y RFP) para poder ver “in vivo” los acontecimientos que están ocurriendo en la célula y que son de su interés. Recientemente habéis podido ver su utilidad para poder observar el desarrollo de una enfermedad similar al SIDA en gatos tal y como podéis ver arriba.

Pero espera… ¿que es GFP, YFP, RFP? Son los acrónimos de Green Fluorescent Protein (GFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP) y Red Fluorescent Protein (RFP).

La GFP es una proteína que produce de forma natural la medusa Aequorea victoria. Esta proteína está constituida por 238 aminoácidos, los cuales forman once cadenas beta consecutivas que forman un cilindro en cuyo centro se encuentra una hélice alfa (espero que a estas alturas ya os hayáis leído la entrada de estructura del blog).

Estructura de la GFP. Fuente: Wikipedia

Esta proteína emite luz en la zona verde del espectro visible, por eso la vemos de color verde cuando iluminamos la célula/tejido/organismo con luz ultravioleta.

Esta proteína bioluminiscente se ha convertido en una herramienta clave en muchos de los experimentos de Biología Molecular y Celular desde hace varios años y nos ha permitido observar la expresión de genes y otras moléculas dentro de células u organismos completos. Las aplicaciones de la GFP son innumerables.

Como siempre, detrás de un gran descubrimiento suele haber grandes científicos que lo han llevado a cabo. De hecho, el descubrimiento, caracterización y aplicación de la GFP fueron el motivo por el que los estadounidenses Martin Chalfie y Roger Tsien y el japonés Osamu Shimomura compartieran el Premio Nobel de Química en 2008.

Osamu Shimomura fue la primera persona en aislar la GFP a partir de la Aequorea victoria e identificar qué parte era responsable de la fluorescencia. Martin Chalfie supo cómo utilizar la GFP para visualizar procesos en Biología Celular y por último, Roger Tsien, diseñó nuevas variantes de la GFP que brillan en distintos colores (YFP, RFP). Si queréis más información sobre aplicaciones que utilizan este tipo de proteínas no os olvidéis de visitar esta entrada del blog Jindetrés sal! del genial @DrLitos.

Utilización de diferentes proteínas fluorescentes en el marcaje de distintos compartimentos celulares. Fuente: Nikon

Es más,  si lo que realmente queréis es la máxima información en profundidad acerca de la cantidad de variantes que existen y las propiedades de estas proteínas tan especiales os recomiendo este enlace (en inglés).

Pero no solo los chicos pijos de Biología Celular tienen colores para “jugar”… En clase, también los tenemos los proteómicos, aunque utilizando una aproximación un poco diferente.

En este caso os voy a explicar como conseguimos nosotros los colores con los que jugar. En definitiva se trata de añadirle a cada una de las muestras que estemos analizando el color que queremos.

Los proteómicos utilizamos para “teñir” las muestras (las proteínas) unos grupos químicos denominados cianinas que podemos unir a las lisinas que tienen las proteínas que estamos analizando.

La técnica con la que conseguimos los colores tiene como nombre DIGE (Differential In Gel Electrophoresis) y corrige los problemas de reproducibilidad, detección de manchas y posterior análisis de la 2-DE convencional. Se basa en las propiedades de 3 tipos de fluoróforos de la familia de las cianinas (CyDye: Cy3, Cy2, Cy5), que emiten luz a distinta longitud de onda.

Normalmente, los reactivos comerciales que se utilizan tienen un grupo reactivo (éster NHS) y están diseñados para formar un enlace covalente con el grupo amino (epsilon) de los aminoácidos de lisina de las proteínas vía unión amida. El fluoróforo añadido a la proteína de esta forma no nos va a varíar el pH de la proteína pero incrementa el tamaño de la misma sólo un poco y por eso se tiene en cuenta a la hora de analizar.

Bien, como os digo, cada muestra se marca con uno de los fluoróforos y, tras el marcaje, se mezclan antes del isoelectroenfoque. De esta forma se separan hasta 3 muestras diferentes (2 problema y 1 control generado al mezclar ambas, ó control interno) en un sólo gel, eliminándose la variación entre geles y asegurando que los efectos de sobre/sub-expresión visualizados en el gel se deben sólo a cambios biológicos. Así, cada mancha de proteína puede ser comparada fácilmente en distintas condiciones de manera semicuantitativa.

Esquema de un experimento DIGE clásico (Fuente: GEHealthcare)

Después de haber realizado la segunda dimensión de la electroforesis los geles con las 3 muestras se digitalizan mediante el uso de un escáner láser que excita a cada cianina en su longitud de onda correspondiente. Así obtenemos de cada gel 3 imágenes como estas:

Imagenes de un experimento DIGE obtenidas con un escáner láser. Fuente: Ludesi

Y una vez que se han obtenido nuestras muestras coloreadas podemos analizarlo mediante un software específico para ello y así poder comprobar que proteínas varían su expresión dependiendo de cada una de las muestras. Es tras el análisis cuando las escindiremos del gel y las analizaremos mediante espectrometría de masas.